Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido
Summary
Presentamos un sistema de exposición in vitro robusto, transferible y predictivo para el cribado y seguimiento de partículas transmitidas por el aire relativas a su citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido (ALI).
Abstract
Aquí, presentamos un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición homogénea de células pulmonares humanas cultivadas en la ALI a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo), proporcionando así exposición de la superficie apical de la región alveolar humana al aire. A diferencia de los modelos de exposición secuencial con guía lineal de aerosoles, el diseño modular del sistema de flujo radial cumple con todos los requisitos para la generación y transporte continuo de la atmósfera de prueba a las células, una distribución y deposición homogénea de las partículas y la eliminación continua de la atmósfera. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición de células a partículas en el aire, pero puede adaptarse a la exposición de aerosoles líquidos y gases altamente tóxicos y agresivos dependiendo del método de generación de aerosoles y el material de los módulos de exposición .
En el marco de un estudio de validación recientemente completado, este sistema de exposición se demostró como un método de cribado transferible, reproducible y predictivo para la evaluación cualitativa de la citotoxicidad pulmonar aguda de partículas en el aire, potencialmente reducir o reemplazar experimentos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.
Introduction
La inhalación de partículas tóxicas en el aire es un problema de salud pública, lo que lleva a una multitud de riesgos para la salud en todo el mundo y muchos millones de muertes al año1,2. El cambio climático, el desarrollo industrial en curso y la creciente demanda de productos energéticos, agrícolas y de consumo han contribuido al aumento de las enfermedades pulmonares en los últimos años3,4,5,6. El conocimiento y la evaluación de sustancias inhalables en relación con su toxicidad aguda por inhalación proporcionan la base para la evaluación del peligro y la gestión del riesgo, pero esta información sigue faltando para una amplia gama de estas sustancias7,8. Desde 2006, la legislación química de la UE REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Productos Químicos) exige que los productos ya existentes y de nueva introducción se sometan a una caracterización toxicológica, incluida la vía de inhalación antes de su comercialización. Por lo tanto, REACH se centra en métodos alternativos y libres de animales, la aplicación del principio “3R” (reemplazo, refinamiento y reducción de experimentos con animales) y el uso de modelos in vitro apropiados9. En los últimos años, se han desarrollado muchos modelos de prueba de toxicidad por inhalación no animal diferentes y adecuados (por ejemplo, cultivos de células in vitro, modelos de pulmón en un chip, rodajas pulmonares cortadas de precisión (PCLS)) con el fin de evaluar la toxicidad aguda por inhalación de partículas en el aire5,7,10,11. En términos de modelos de cultivo celular in vitro, las células cultivadas pueden exponerse en condiciones sumergidas o en la ALI(Figura 1). Sin embargo, la validez de los estudios de exposición sumergida es limitada con respecto a la evaluación de la toxicidad de los compuestos en el aire, especialmente las partículas. Las técnicas de exposición sumergida no se corresponden con la situación humana in vivo; el medio de cultivo celular que cubre las células puede afectar a las propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, las propiedades tóxicas de una sustancia de ensayo12,13. Los modelos de inhalación in vitro DE ALI permiten la exposición directa de las células a las sustancias de ensayo sin interferencias del medio de cultivo celular con partículas de ensayo, imitando así la exposición humana con mayor similitud fisiológica y biológica que las exposiciones sumergidas12,14.
No obstante, en el caso de procesos reglamentarios como REACH, sólo se dispone de modelos animales en el ámbito de la toxicología aguda por inhalación, ya que hasta el momento no se han validado suficientemente suficientemente y aceptado oficialmente métodos in vitroalternativos. A tal fin, los modelos de ensayo deben validarse de acuerdo con los requisitos del Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a ensayos con animales (EURL-ECVAM) sobre la validez de los ensayos15.
Un antiguo estudio de prevalidación y un estudio de validación recientemente completado demostraron con éxito el área de aplicación del sistema de exposición CULTEX RFS y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad13. Este sistema de exposición es un sistema de exposición in vitro basado en células que permite la exposición homogénea de las células a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo) en la ALI debido a su concepto de distribución radial de aerosoles y la conducción del aerosol de ensayo en un flujo continuo sobre las células16. El módulo básico de este sistema de flujo radial consiste en el adaptador de entrada, el módulo de guía de aerosol con una distribución radial de aerosoles, el módulo de muestreo y zócalo, y un módulo de bloqueo con una rueda de mano(Figura 2). Las partículas generadas llegan a las células a través del adaptador de entrada y el módulo de guiado de aerosol y se depositan en las plaquitas de cultivo celular, que se encuentran en las tres cámaras de exposición dispuestas radialmente del módulo de muestreo. El módulo de guía de aerosoles, así como el módulo de muestreo se pueden calentar mediante la conexión a un baño de agua externo17.
En el marco de ambos estudios, se utilizaron células A549 para todos los experimentos de exposición. La línea celular A549 es una línea celular epitelial inmortalizada humana que está muy bien caracterizada y se ha utilizado como modelo in vitro para células epiteliales alveolares de tipo II en numerosos estudios toxicológicos. Las células se caracterizan por cuerpos lamelares, la producción de surfactante y una serie de factores relevantes para la inflamación18. También muestran propiedades de las células epiteliales bronquiales debido a su producción de moco19. Además, se pueden cultivar en la ALI. Aunque esta línea celular es deficiente en la construcción de contactos de células celulares, el cultivo de estas células es mucho más conveniente, menos costoso costo y los resultados derivados de las mismas son independientes del donante en comparación con las células primarias20.
Las células A549 fueron sembradas en insertos de cultivo celular de 6 polos (membrana PET, 4,67 cm2,tamaño de poro 0,4 mm) con una densidad de 3,0 x 105 células por inserto y se cultivaron durante 24 h en condiciones sumergidas. Las células fueron expuestas en tres laboratorios independientes para limpiar el aire y tres dosis de exposición diferentes (25, 50 y 100 g/cm2) de 20 sustancias de ensayo en la ALI. La dosis de exposición se correlaciona con el tiempo de deposición, lo que da como resultado una velocidad de partícula constante de 25 g/cm2, 50 g/cm2 y 100 g/cm2 en las células después de 15, 30 o 60 min, respectivamente. Las partículas depositadas, sin embargo, no fueron lavadas después de la deposición, sino que permanecieron en las células durante 24 h. Los tiempos de deposición de las partículas eran por lo tanto 15, 30 y 60 min, pero la exposición de las células duró 24 h en total. La tasa de deposición de las sustancias de ensayo se determinó en experimentos preliminares de acuerdo con los métodos anteriores17.
La viabilidad celular como indicador de toxicidad se evaluó 24 horas después de la deposición de partículas utilizando un ensayo de viabilidad celular. Se centró especial mente en la calidad de los controles de aire limpio, la optimización y el refinamiento del protocolo de exposición, la reproducibilidad intra e interlaboratorio y el establecimiento de un modelo de predicción (PM). Sustancias que llevaron a una disminución de la viabilidad celular por debajo del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) en cualquiera de las tres dosis de exposición se consideró que ejercen un riesgo agudo de inhalación. Los resultados se compararon entonces con los datos in vivo existentes (basados en al menos un estudio fiable según la directriz de ensayo de la OCDE (TG) 403 o TG 43621,22), lo que llevó a una concordancia global del 85%, con una especificidad del 83% y una sensibilidad del 88%23.
Además de la medición de la viabilidad celular, se pueden evaluar otros puntos finales como la liberación de citoquinas, el examen del lisado celular o la integridad de la membrana a través del ensayo LDH, pero no fueron necesarios para el estudio de validación. Así, el sistema de exposición (por ejemplo, CULTEX RFS) se demostró como un sistema de cribado predictivo para la evaluación cualitativa de la toxicidad aguda por inhalación de las partículas transmitidas por el aire probadas, lo que representa un método alternativo prometedor a las pruebas en animales. El siguiente protocolo se recomienda para experimentos de exposición a partículas en el aire utilizando este sistema de exposición.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los últimos años se han desarrollado muchos modelos de pruebas de toxicidad por inhalación no animal con el fin de obtener información sobre el riesgo agudo de inhalación de partículas inhalables y para reducir y sustituir los experimentos con animales de acuerdo con el principio 3R25.
En términos de modelos de cultivo celular, la exposición de células se puede hacer en condiciones sumergidas o en la ALI. La exposición de células en condiciones sumergidas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Alemania (Grant 031A581, subproyecto A-D)) y por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Formación en Investigación GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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