Prøveforberedelse i kvarts krystal Mikrobalance målinger af protein adsorption og polymer mekanik

Summary

Kvarts krystal mikrobalance kan give nøjagtige masse og viskoelastiske egenskaber for film i micron eller submikron Range, som er relevant for undersøgelser i biomedicinsk og miljømæssig sensing, belægninger, og polymer videnskab. Prøve tykkelsen påvirker, hvilke oplysninger der kan fås fra det materiale, som er i kontakt med sensoren.

Abstract

I denne undersøgelse præsenterer vi forskellige eksempler på, hvordan tynd film forberedelse til kvarts krystal mikrobalance eksperimenter informerer den relevante modellering af dataene og afgør, hvilke egenskaber af filmen kan kvantificeres. Quartz Crystal Micro balance tilbyder en unikt følsom platform til måling af fine ændringer i masse og/eller mekaniske egenskaber af en anvendt film ved at observere ændringer i mekanisk resonans af en kvarts krystal oscere ved høj frekvens. Fordelene ved denne fremgangsmåde omfatter dens eksperimentelle alsidighed, evne til at studere ændringer i egenskaber over en bred vifte af eksperimentelle tids længder, og brugen af små prøvestørrelser. Vi viser, at baseret på tykkelsen og forskydnings modulus af laget deponeret på sensoren, kan vi erhverve forskellige oplysninger fra materialet. Her er dette koncept specifikt udnyttes til at vise eksperimentelle parametre resulterer i masse og viskoelastisk beregninger af adsorbede kollagen på guld og polyelektrolyt komplekser under hævelse som en funktion af saltkoncentration.

Introduction

Kvarts krystal mikrobalance (QCM) udnytter den piezoelektriske effekt af en kvarts krystal til at overvåge sin resonansfrekvens, som er afhængig af massen klæbet til overfladen. Teknikken sammenligner resonansfrekvens og båndbredde af en på cut kvarts krystal sensor (typisk i intervallet 5 MHz)¹ i luft eller en væske til hyppigheden og båndbredden af sensoren efter deposition af en film. Der er flere fordele ved at bruge qcm til at studere tynde film egenskaber og grænseflader, herunder den høje følsomhed over for masse og potentielt viskoelastiske ændringer i ejendom (afhængigt af prøve ensartethed og tykkelse), evnen til at udføre undersøgelser på situ², og evnen til at sonde en meget kortere rheologisk tidshorisont end traditionelle shear reologi eller dynamisk mekanisk analyse (DMA). Sondering af en kort rheologisk tidshorisont giver mulighed for observation af, hvordan reaktionen på denne tidshorisont ændrer både over ekstremt korte (MS)³ og lange (år) varigheder⁴. Denne evne er gavnlig for studiet af en række kinetiske processer og er også en nyttig forlængelse af traditionelle rheometriske teknikker^5,6.

Den høje følsomhed af QCM har også ført til sin tunge brug i biologiske applikationer studere de grundlæggende interaktioner af ekstremt små biomolekyler. En ubelagt eller funktionaliseret sensor overflade kan anvendes til at undersøge protein adsorption; yderligere kan plasmonic gennem komplekse bindende hændelser mellem enzymer, antistoffer og aptamers undersøges på grundlag af ændringer i massen^7,8,9. For eksempel, teknikken er blevet brugt til at forstå omdannelsen af vesikler til en planar lipid-tolags som en to-faset proces af adsorptions af væske-holdige vesikler til en stiv struktur ved at observere korrelation ændringer i frekvens og viskoelasticitet¹⁰. I de senere år har QCM desuden tilbudt en robust platform til overvågning af lægemiddel levering med vesikler eller nanopartikler¹¹. Ved skæringspunktet mellem Materialeteknik og molekylær og cellulær biologi kan vi bruge QCM til at belyse nøgle interaktioner mellem materialer og bioaktive komponenter som proteiner, nukleinsyrer, Liposomer og celler. For eksempel, protein adsorptions til et biomateriale medierer downstream cellulære reaktioner såsom inflammation og bruges ofte som en positiv indikator for biokompatibilitet, mens i andre tilfælde ekstracellulære protein fastgørelse til belægninger, der grænseflade med blod kan fremkalde farlig størkning i fartøjer^12,13. QCM kan derfor bruges som et værktøj til at udvælge kandidater optimalt til forskellige behov.

To almindeligt forekommende tilgange til udførelse af QCM-eksperimenter samler analoge data fra eksperimentet: den første metode registrerer frekvens skiftet og den halve båndbredde (Γ) af konduktionens spids. Den anden fremgangsmåde, QCM med afledning (QCM-D), registrerer frekvens skiftet og afledning faktor, som er direkte proportional med Γ gennem ligning 1,¹⁴

1

hvor D er den afledning faktor og ƒ er frekvensen. Både D og Γ er relateret til dæmpnings effekten filmen har på sensoren, hvilket giver en indikation af stivheden af filmen. Sænket skrift n betegner frekvensen overtone eller harmonisk, som er den ulige resonansfrekvenser af kvarts sensoren (n = 1, 3, 5, 7…). Yderligere diskussion af modeller ved hjælp af flere harmoniske for at opnå de masse og viskoelastiske egenskaber af en film kan findes i en anmeldelse af johannsmann¹⁴ og tidligere papirer fra shull Group^15,16,17,18.

En vigtig overvejelse for at forberede QCM prøver er, hvordan man anvender den tynde film på sensoren overflade. Nogle almindeligt forekommende metoder omfatter spin belægning, dip belægning, drop coating, eller adsorptions af filmen på sensoren overflade under eksperimentet^19,20. Der er fire regioner for QCM-prøver: Sauerbrey-grænsen, det viskoelastiske regime, bulk-regimet og det over dampede regime. For tilstrækkeligt tynde film gælder grænsen for Sauerbrey, hvor frekvens skiftet (Δƒ) giver en overflade massetæthed af filmen. Inden for Sauerbrey-grænsen skaleres frekvens skiftet lineært med resonans harmoniske, n, og ændringer i Dæmpningsfaktoren (D eller Γ) er generelt små. I dette regime foreligger der ikke tilstrækkelige oplysninger til entydigt at bestemme lagets rheologiske egenskaber uden at fremsætte yderligere antagelser. Data i denne ordning anvendes til at beregne overfladens massetæthed (eller tykkelse, hvis tætheden er kendt a priori) af filmen. I bulk regime, hvor mediet i kontakt med krystal er tilstrækkeligt tyk, den passive shear bølge udbreder i mediet, før den er helt fugtet. Her kan der ikke indhentes masse oplysninger ved hjælp af Δƒ. I denne region bestemmes de viskoelastiske egenskaber dog pålideligt ved hjælp af kombinationen af Δƒ og δγ ^15,18. I bulk regime, hvis mediet er for stiv, vil filmen fugt ud resonansen af sensoren, forhindrer indsamlingen af eventuelle pålidelige data fra QCM. Det viskoelastiske regime er det mellemliggende regime, hvor filmen er tynd nok til at have forskydnings bølgen fuldt udformeret gennem filmen samt have pålidelige værdier for Dæmpningsfaktoren. Dæmpningsfaktoren og Δƒ kan derefter anvendes til at bestemme filmens viskoelastiske egenskaber samt dens masse. Her er de viskoelastiske egenskaber givet af produktet af tætheden og størrelsen af den komplekse shear modulus | G* | p og den fasevinkel, som er givet af Φ = ARCTAN (g “ / g”). Når film fremstilles i Sauerbrey-grænsen, kan massen pr. arealenhed beregnes direkte på grundlag af Sauerbrey-ligningen, der er vist under²¹,

2

hvor δƒ_n er ændringen i resonansfrekvensen, n er over tonen af interesse, ƒ₁ er resonansfrekvens af sensoren, Δm / A er massen pr område af filmen, og Z_q er den akustiske impedans af kvarts, som for at cut kvarts er z_q = 8,84 x 10⁶kg / m²s. Det viskoelastiske regime er mest velegnet til studiet af polymer film, og bulk-grænsen er nyttig til at studere viskøs polymer²² eller proteinopløsninger¹⁶. De forskellige regimer afhænger af egenskaberne af det materiale af interesse, med den optimale tykkelse for fuld viskoelastisk og masse karakterisering generelt stigende med filmen stivhed. Figur 1 beskriver de fire regioner med hensyn til den areal tæthed af filmen, komplekse shear modulus, og fasevinkel, hvor vi har antaget en specifik sammenhæng mellem fasevinkel og film stivhed, der har vist sig at være relevant for materialer af denne type. Mange film af praktisk interesse er for tykke til at studere de viskoelastiske egenskaber med QCM, såsom visse biofilm, hvor tykkelserne er på rækkefølgen af snesevis til hundredvis af mikron²³. Sådanne tykke film er generelt ikke egnet til at studere ved hjælp af QCM, men kan måles ved hjælp af meget lavere frekvens resonatorer (såsom torsions resonatorer)²³, hvilket gør det muligt for forskydnings bølgen at udbrede yderligere ind i filmen.

For at afgøre, hvilken ordning der er relevant for en given qcm-prøve, er det vigtigt at forstå parameteren d /λ_n , som er forholdet mellem filmens tykkelse (d) og forskydnings bølgelængden for den mekaniske svingning af kvarts krystal sensoren (λ_n)^15,16,18. Den ideelle viskoelastisk regime er d /λ_n = 0,05-0,2¹⁸, hvor værdier under 0,05 er inden for Sauerbrey grænse og værdier over 0,2 nærmer bulk regime. En mere stringent beskrivelse af d /λ_n er givet andetsteds^15,18, men det er en kvantitativ parameter afgrænse Sauerbrey grænse og viskoelastisk grænse. De analyseprogrammer, der bruges nedenfor, angiver denne parameter direkte.

Der er nogle yderligere begrænsninger for at analysere tynde film med QCM. De Sauerbrey og viskoelastiske beregninger antager, at filmen er homogen både i hele filmens tykkelse og sideværts over elektrodeoverfladen af QCM. Selv om denne antagelse gør det udfordrende at studere film, der har hulrum eller fyldstoffer til stede, har der været nogle QCM undersøgelser af film bestående af podede nanopartikler⁶. Hvis forskelligartethed er små sammenlignet med den samlede filmtykkelse, kan der stadig opnås pålidelige viskoelastiske egenskaber af det sammensatte system. For mere heterogene systemer bør værdier opnået fra en viskoelastisk analyse altid ses med stor forsigtighed. Ideelt set bør resultater opnået fra systemer med ukendt heterogenitet valideres i forhold til systemer, der vides at være homogene. Det er den fremgangsmåde, vi har benyttet i det eksempel, der beskrives i dette dokument.

Et vigtigt punkt, som vi illustrerer i dette papir er den nøjagtige korrespondance mellem QCM målinger udført i frekvens domænet (hvor Γ er rapporteret) og tids domæne eksperimenter (hvor D er rapporteret). Resultater fra to forskellige QCM-eksperimenter, et tids domæne og et frekvens domæne, er beskrevet, hver med et andet, men konceptuelt beslægtet model system. Det første system er et simpelt eksempel på kollagen fastgørelse til sensoren for at illustrere repræsentative bindende kinetik og ækvibrering af adsorptions over tid i løbet af en tid domæne (QCM-D) måling. Kollagen er den mest rigelige protein i kroppen, kendt for sin alsidighed af bindende adfærd og morfologi. Den kollagenopløsning, der anvendes her, kræver ikke yderligere funktionalisering af sensorens gyldne overflade for at inducere adsorptions⁹. Det andet eksperimentelle system er et polyelektrolyt kompleks (PEC) sammensat af anionisk polystyren sulfonat (PSS) og kationisk poly (diallyldimethylammonium) (PDADMA), der er fremstillet på samme måde som Sadman et al.²². Disse materialer svulmer og bliver bløde i salt (KBr i dette tilfælde) løsninger, der tilbyder en enkel platform til at studere polymer mekanik ved hjælp af en frekvens domæne tilgang (QCM-Z). For hver protokol vises processen med at forberede, tage og analysere en måling i figur 2. Skematisk viser, at den væsentligste forskel mellem QCM-Z og QCM-D tilgange er i dataindsamlings trinnet og instrumentering, der anvendes i forsøget. Alle de nævnte prøve forberedelses teknikker er kompatible med begge tilgange, og hver tilgang kan analysere prøver i de tre regioner, der er afbildet i figur 1.

Vores data viser, at forberedelsen af prøver, enten ved sensor belægning før eller under en måling, dikterer evnen til at udtrække de viskoelastiske egenskaber af et system. Ved at designe de tidlige stadier af et eksperiment korrekt, kan vi bestemme, hvilke oplysninger vi præcist kan samle i løbet af analyse trinnet.

Protocol

QCM-D kollagen adsorption 1. prøveforberedelse og sensor Forrengøring Du skal tilberede 20 mL 0,1 M acetatbuffer, justere pH-værdien med HCl og NaOH efter behov for at opnå pH = 5,6. Der tilsættes Rottehale kollagen opløsning til 20 mL acetatbuffer under sterile forhold til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Rengør den guldbelagte kvarts sensor for at fjerne organisk og biologisk materiale25,<sup clas…

Representative Results

De ændringer i hyppighed med tid under protein adsorptions udviser en karakteristisk kurve og plateau vist i figur 3a-B. Den første buffer vask på 1x PBS på tværs af den bare sensor overflade inducerer kun ubetydelige ændringer i frekvensen, hvilket giver en stabil baseline til at fungere som en reference for fremtidige datapunkter. Indførelsen af kollagen opløsning forårsager protein adsorptions til at begynde, observeret som en støt fald i hyppighed over tid, ind…

Discussion

Kollagen adsorptions resultaterne spænder over Sauerbrey og viskoelastiske regimer. Ved at plotte frekvens forskydningerne normaliseret til det tilsvarende harmoniske tal, bemærker vi, at Sauerbrey-grænsen gælder for omtrent de første 2 timer af målingen. Med en stigende masse, der klæber til sensoren, begynder de normaliserede frekvens forskydninger for den tredje og femte harmonika dog at afvige fra hinanden (t > 2 timer), hvilket indikerer en evne til at bestemme den adsorbede Films viskoelastiske egen…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling