Provberedning i kvartskristall Microbalance mätningar av Proteinadsorption och Polymermekanik

Summary

Den Quartz Crystal Microbalance kan ge noggrann massa och viskoelastiska egenskaper för filmer i micron eller submicron sortiment, som är relevant för utredningar inom biomedicinsk och miljö-avkänning, beläggningar och polymer vetenskap. Prov tjockleken påverkar vilken information som kan erhållas från materialet i kontakt med sensorn.

Abstract

I denna studie presenterar vi olika exempel på hur tunn film förberedelse för kvartskristall Microbalance experiment informerar lämplig modellering av data och avgör vilka egenskaper av filmen kan kvantifieras. Den Quartz Crystal Microbalance erbjuder en unikt känslig plattform för att mäta fina förändringar i massa och/eller mekaniska egenskaper hos en tillämpad film genom att observera förändringarna i mekanisk resonans av en kvartskristall oscillerande på hög frekvens. Fördelarna med detta tillvägagångssätt inkluderar dess experimentella mångsidighet, förmåga att studera förändringar i egenskaper över ett brett spektrum av experimentella tidslängder, och användningen av små urvalsstorlekar. Vi visar att, baserat på tjocklek och skjuvning Modulus av skiktet deponeras på sensorn, kan vi få olika information från materialet. Här är detta begrepp speciellt utnyttjas för att Visa experimentella parametrar som resulterar i massa och viskoelastiska beräkningar av adsorberat kollagen på guld och polyelektrolyt komplex under svullnad som en funktion av salt koncentration.

Introduction

Kvartskristall Microbalance (QCM) utnyttjar den piezoelektriska effekten av en kvartskristall för att övervaka dess resonant frekvens, som är beroende av massan anslutit sig till ytan. Tekniken jämför resonant frekvens och bandbredd av en vid cut Quartz Crystal sensor (typiskt i intervallet 5 MHz)¹ i luft eller en vätska till frekvens och bandbredd av sensorn efter nedfall av en film. Det finns flera fördelar med att använda QCM för att studera tunnfilms egenskaper och gränssnitt, inklusive hög känslighet för massa och potentiellt till viskoelastiska egenskaps förändringar (beroende på prov enhetlighet och tjocklek), förmågan att utföra studier på plats², och förmågan att söka en mycket kortare reologiska tidsperiod än traditionell skjuvning reologi eller dynamisk mekanisk analys (DMA). Genom att sondera en kort relogisk tidsskala kan observationen av hur responsen i denna tidsskala förändras både under extremt korta (MS)³ och långa (år) varaktigheter⁴. Denna förmåga är fördelaktigt för studiet av en mängd olika kinetiska processer och är också en användbar förlängning av traditionella rheometriska tekniker^5,6.

Den höga känsligheten hos QCM har också lett till dess tunga användning i biologiska tillämpningar som studerar de grundläggande interaktionerna hos extremt små biomolekyler. En obelagd eller funktionaliserad sensoryta kan användas för att undersöka proteinadsorption; Ytterligare, Avkännings genom komplexa bindande händelser mellan enzymer, antikroppar, och aptamers kan undersökas baserat på förändringar i massan^7,8,9. Till exempel har tekniken använts för att förstå omvandlingen av vesikler till en planar lipidbilayer som en två-fas process av adsorption av vätska som innehåller blåsor till en styv struktur genom att observera korrelera förändringar i frekvens och viskoelasticiteten¹⁰. Under de senaste åren har QCM dessutom erbjudit en robust plattform för att övervaka läkemedelsleverans genom vesikler eller nanopartiklar¹¹. I skärningspunkten mellan materialteknik och molekylär och cellulär biologi kan vi använda QCM för att belysa viktiga interaktioner mellan material och bioaktiva komponenter som proteiner, nukleinsyror, liposomer och celler. Till exempel, protein adsorption till ett biomaterial förmedlar nedströms cellulära svar såsom inflammation och används ofta som en positiv indikator på biokompatibilitet, medan i andra fall extracellulära protein fastsättning att beläggningar som gränssnitt med blod kan framkalla farlig koagulering i fartyg^12,13. QCM kan därför användas som ett verktyg för att välja kandidater som är optimala för olika behov.

Två vanliga metoder för att utföra QCM experiment samla in analoga data från experimentet: den första metoden registrerar frekvens skiftet och halva bandbredden (Γ) av värmeledningsförmåga Peak. Den andra metoden, QCM med försvinnande (QCM-D), registrerar frekvens förskjutningen och avledning faktorn, som är direkt proportionell mot Γ genom ekvation 1,¹⁴

1

där D är avledning faktorn och ƒ är frekvensen. Både D och Γ är relaterade till dämpnings effekten som filmen har på sensorn, vilket ger en indikation på styvheten i filmen. Nedsänkt n betecknar frekvens övertonen eller övertoningen, som är kvarts sensorns udda resonansfrekvenser (n = 1, 3, 5, 7…). Vidare diskussion av modeller med hjälp av flera övertoner för att få massa och viskoelastiska egenskaper hos en film kan hittas i en recension av johannsmann¹⁴ och tidigare artiklar från Shull Group^15,16,17,18.

En viktig faktor för att förbereda QCM-prover är hur man applicerar den tunna filmen på sensorns yta. Några vanliga metoder inkluderar spinn beläggning, DIP beläggning, droppe beläggning, eller adsorption av filmen på sensorn ytan under experimentet^19,20. Det finns fyra regioner för QCM-prover: Sauerbrey-gränsen, viskoelastiska regimen, bulksystemet och den överansträngda regimen. För tillräckligt tunt filmar, Sauerbrey begränsar applicerar, var frekvens förskjutningen (Δƒ) ger ytbehandla samlas täthet av filma. Inom Sauerbrey gräns skalor frekvens Skift linjärt med resonant Harmonic, n, och förändringar i Dämpfaktor (D eller Γ) är i allmänhet små. I detta system är tillräcklig information inte tillgänglig för att unikt bestämma de reologiska egenskaperna hos skiktet utan att göra ytterligare antaganden. Data i denna regim används för att beräkna ytan massa densitet (eller tjocklek om densiteten är känd a priori) av filmen. I bulk regim där mediet i kontakt med kristallen är tillräckligt tjock, den försvinnande skjuvning vågen sprider sig till mediet innan de helt dämpas. Här kan ingen massinformation erhållas med Δƒ. Men i denna region bestäms de viskoelastiska egenskaperna tillförlitligt med kombinationen av Δƒ och δγ ^15,18. I bulk regimen, om mediet är för stel, kommer filmen att dämpa resonans av sensorn, vilket förhindrar insamling av tillförlitliga data från QCM. Den viskoelastiska regimen är den mellanliggande regim där filmen är tunn nog att ha skjuvvågen fullt propagera genom filmen samt ha pålitliga värden för Dämpningsfaktorn. Dämpningsfaktorn och Δƒ kan sedan användas för att bestämma de viskoelastiska egenskaperna hos filmen samt dess massa. Här ges viskoelastiska egenskaper av produkten av densiteten och omfattningen av komplexa skjuvning modulus | G* | p och fasvinkeln som ges av Φ = ARCTAN (g “ / g”). När filmer bereds i Sauerbrey-gränsen kan massan per ytenhet beräknas direkt baserat på den Sauerbrey-ekvation som visas under²¹.

2

var Δƒ_n är ändringen i resonanten frekvens, n är övertonen av intresserar, ƒ₁ är den resonant frekvensen av avkännaren, Δm / A är samlas per område av filma, och Z_q är den akustiska impedansen av kvartar, som för på snittet kvartar är Z_q = 8,84 x 10⁶kg / m²s. Den viskoelastiska regimen är lämpligast för studiet av polymerfilmer, och bulkgränsen är användbar för att studera trögflytande polymer²² eller proteinlösningar¹⁶. De olika regimerna beror på egenskaperna hos det material av intresse, med optimal tjocklek för full viskoelastiska och massa karakterisering allmänhet ökar med filmen styvhet. Figur 1 beskriver de fyra regionerna med avseende på filtrets ytdensitet, komplexa skjuvmodulus och fasvinkel, där vi har antagit ett specifikt förhållande mellan fasvinkeln och den film styvhet som har visats vara relevant för material av denna typ. Många filmer av praktiskt intresse är för tjocka för att studera viskoelastiska egenskaper med QCM, såsom vissa biofilmer, där tjocklekar är på order av tiotals till hundratals mikrometer²³. Sådana tjocka filmer är i allmänhet inte lämpliga för att studera med hjälp av QCM, men kan mätas med hjälp av mycket lägre frekvens resonatorer (såsom vridresonatorer)²³, vilket gör att skjuvvågen att propagera längre in i filmen.

För att avgöra vilken regim som är relevant för ett givet QCM-prov är det viktigt att förstå d /λ_n -parametern, som är förhållandet mellan filmtjockleken (d) och skjuvvåglängden för den mekaniska svängningen i kvartskristall sensorn (λ_n)^15,16,18. Den ideala viskoelastiska regimen är d /λ_n = 0,05-0,2¹⁸, där värden under 0,05 ligger inom sauerbrey-gränsen och värdena över 0,2 närmar sig bulksystemet. En mer rigorös Beskrivning av d /λ_n ges på andra ställen^15,18, men det är en kvantitativ parameter som avgränsningen av Sauerbrey-gränsen och viskoelastiska gränsen. De analysprogram som används nedan ger den här parametern direkt.

Det finns några ytterligare begränsningar för att analysera tunna filmer med QCM. Den Sauerbrey och viskoelastiska beräkningar förutsätter att filmen är homogen både under hela filmtjockleken och sidled över elektrod ytan av QCM. Även om detta antagande gör det svårt att studera filmer som har tomrum eller fyllmedel närvarande, har det förekommit några QCM utredningar i filmer som består av ympade nanopartiklar⁶. Om heterolikteterna är små jämfört med den totala filmtjockleken, kan tillförlitliga viskoelastiska egenskaper hos det sammansatta systemet fortfarande erhållas. För mer heterogena system, värden som erhålls från en viskoelastiska analys bör alltid ses med stor försiktighet. De resultat som erhålls från system med okänd heterogenitet bör helst valideras mot system som är kända för att vara homogena. Detta är den strategi som vi har tagit i det exempel system som beskrivs i detta dokument.

En viktig punkt som vi illustrerar i detta dokument är den exakta överensstämmelsen mellan QCM mätningar görs i frekvensdomänen (där Γ rapporteras) och tidsdomän experiment (där D rapporteras). Resultaten från två olika QCM-experiment, en tidsdomän och en frekvens domän, beskrivs, var och en med ett annat men begreppsmässigt relaterat modellsystem. Det första systemet är ett enkelt exempel på kollagen infästning till sensorn för att illustrera representativ bindningskinetik och jämvikt av adsorption över tiden under en tidsdomän (QCM-D) mätning. Kollagen är det mest förekommande proteinet i kroppen, känd för sin mångsidighet av bindande beteenden och morfologi. Den kollagen lösning som används här kräver inte ytterligare funktionalisering av sensorns guld yta för att inducera adsorption⁹. Det andra experimentella systemet är ett polyelektrolytkomplex (PEC) som består av anjoniskt polystyrensulfonat (PSS) och katjoniska poly (diallyldimetylammonium) (PDADMA) som bereds på samma sätt som Sadman m.²². Dessa material sväller och blir mjuka i salt (KBr i detta fall) lösningar, som erbjuder en enkel plattform för att studera polymermekanik med hjälp av en frekvens domän strategi (QCM-Z). För varje protokoll visas processen att förbereda, ta och analysera en mätning i figur 2. Den schematiska visar att den största skillnaden mellan QCM-Z och QCM-D-metoder är i datainsamlings steget och instrumenteringen som används i experimentet. Alla de nämnda prov berednings teknikerna är förenliga med båda metoderna, och varje metod kan analysera prover i de tre regioner som avbildas i figur 1.

Våra data visar att beredningen av prover, vare sig genom sensor beläggning före eller under en mätning, dikterar förmågan att extrahera viskoelastiska egenskaper hos ett system. Genom att utforma de tidiga stadierna i ett experiment på lämpligt sätt kan vi avgöra vilken information vi kan samla in exakt under analys steget.

Protocol

QCM-D kollagen adsorption 1. provberedning och sensor för rengöring Förbered 20 mL 0,1 M acetatbuffert, justera pH med HCl och NaOH som behövs för att uppnå pH = 5,6. Tillsätt rått svans kollagen lösning till 20 mL acetatbuffert under sterila förhållanden till en slutlig koncentration av 10 μg/mL. Rengör den guldbelagda kvarts sensorn för att avlägsna organiskt och biologiskt material25,<sup class=…

Representative Results

Förändringarna i frekvens med tiden under proteinadsorption uppvisar en karakteristisk kurva och platå som visas i figur 3a-B. Den initiala bufferttvätten på 1x PBS över den kala sensorns yta inducerar endast försumbara förändringar i frekvens, vilket ger en stadig baslinje för att fungera som referens för framtida datapunkter. Införandet av kollagen lösning orsakar proteinadsorption att börja, observeras som en stadig minskning av frekvensen över tiden, tills…

Discussion

Kollagen adsorptionsresultaten spänner över Sauerbrey och viskoelastiska regimer. Genom att plotta frekvens Skift normaliserade till motsvarande harmoniska tal, vi Observera att Sauerbrey gränsen gäller för ungefär de första 2 h av mätningen. Med ökande massa ansluter sig till sensorn, dock normaliserade frekvens SKIFT för den tredje och femte övertoner börjar avvika från varandra (t > 2 h), vilket indikerar en förmåga att bestämma viskoelastiska egenskaper av adsorberad film.

<p class="jove_…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling