Vi presenterer en protokoll for ekstraksjon av murine cerebral pericytes. Basert på en antibiotika-fri berikelse orientert pericyte utvinning, er denne protokollen et verdifullt verktøy for in vitro studier som gir høy renhet og høy avkastning, og dermed redusere antall eksperimentelle dyr som brukes.
I de senere årene har cerebral pericytes blitt fokus for omfattende forskning på vaskulær biologi og patologi. Betydningen av pericytes i blod hjerne barriere formasjon og fysiologi er nå demonstrert, men molekyl grunnlaget er fortsatt i stor grad ukjent. Som patofysiologiske rolle cerebral pericytes i nevrologiske lidelser er spennende og av stor betydning, in vitro-modeller er ikke bare tilstrekkelig hensiktsmessig, men også i stand til å innlemme ulike teknikker for disse studiene. Flere metoder har blitt foreslått som in vitro modeller for utvinning av cerebral pericytes, selv om en antibiotika-fri protokoll med høy produksjon er ønskelig. Viktigst, en metode som har økt produksjon per ekstraksjon reduserer bruken av flere dyr.
Her foreslår vi en enkel og effektiv metode for å utvinne cerebral pericytes med tilstrekkelig høy effekt. Musen hjernevev homogenate er blandet med en BSA-dextran løsning for separasjon av vevet rusk og mikrovaskulær pellet. Vi foreslår en tre-trinns separasjon etterfulgt av filtrering for å få en microvessel rik Filtrer. Med denne metoden er mengden av mikrovaskulær fragmenter innhentet fra 10 mus tilstrekkelig til å frø 9 brønner (9,6 cm2 hver) av en 6-brønn plate. Mest interessant med denne protokollen, kan brukeren få 27 pericyte rike brønner (9,6 cm2 hver) i passasje 2. Renheten av pericyte kulturer er bekreftet med uttrykk for klassisk pericyte markører: NG2, PDGFR-β og CD146. Denne metoden demonstrerer en effektiv og gjennomførbar in vitro-verktøy for fysiologiske og patofysiologiske studier på pericytes.
Cerebral pericytes er en viktig del av nevrovaskulære enheten (NVU), som består av en funksjonell enhet med cerebral endothelial celler av blod hjerne barrieren (BBB), gliacellene celler, ekstracellulære matrise og neurons. Pericytes er en viktig del i regulert funksjon av sentralnervesystemet (CNS) som de tjener som en av grensesnittene for utveksling av molekylær og mobilinformasjon.
Cerebral pericytes er innebygd i abluminal siden av hjernen microårene, og er avgjørende for å etablere1 og OPPRETTHOLDE2 BBB fysiologi. Flere nyere verker har også fremhevet rollen som cerebral pericytes i angiogenese3 og fartøy modning4, endothelial morphogenesis5 og overlevelse6, og i kontrollerende hjernen kolesterol metabolisme7. Viktigere er feilregulering i noen av disse prosessene paranoid kjennetegn ved nevrodegenerative sykdommer.
Faktisk, pericytes er en funksjonell nødvendighet for normal BBB funksjon og dens beskyttelse mot progresjon av flere nevrologiske sykdommer. Degenereres fysiologi og tap av pericytes er vanlig fellesnevnere i progresjon av Alzheimers sykdom8, neuronal tap under hvit materie dysfunksjon9, multippel sklerose10, i en periode på 12, akuttfase iskemiske hjerneslagtolv og i andre nevrologiske lidelser. Pericytes er også instrumental i tumor metastasering13. Interessant, pericytes har også vist å vise en redning rolle etter nevrologiske traumer og lidelser: i remyelination i hjernen1, iskemiske hjerneslag, ryggmargsskade14 og fremme angiogenese15. Mottakelighet for pericytes å forsterke den patofysiologiske manifestasjon av nevrologiske traumer og lidelser gjør dem til en potensiell terapeutisk mål16.
In vitro forskning modeller av pericytes i BBB er viktige verktøy for å gjennomføre omfattende studier. Disse modellene gir en plattform for mer forseggjort studier ved å representere arbeider modeller av BBB og mer. For eksempel kan disse modellene brukes til å forstå cellulære fysiologi innen pericytes og blant andre celletyper av NVU. Også, in vitro-modeller er førstehånds etterforskning verktøy for å teste farmakologisk påvirkning av nye stoffer og molekyler på pericytes. Disse modellene kan også brukes til å forstå patofysiologiske rolle pericytes i forhold til nevrologiske lidelser. Utviklingen av in vitro-modeller krever likevel økt effekt for å muliggjøre eksperimentell frihet. Disse modellene skal være enkelt og raskt, og redusere antall eksperimentelle dyr som brukes. I tillegg er evnen til å utvikle slike modeller til en dobbel og trippel cellekultur modeller ønskelig.
Det er mange protokoller som er utviklet. Protokollene foreslått av Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, og Crouch og Doetsch21 er prisverdig tilnærminger som tilfredsstiller de fleste nødvendigheter. Alle disse metodene gir effektive resultater, men avhengigheten av et stort antall forsøksdyr er fortsatt et felles for disse protokollene. Derfor blir det obligatorisk å utvikle en høy produksjon metode som kan isolere og rense pericytes med størst mulig effektivitet. I denne protokollen, renheten av cellene oppnådd etter en andre passasje er verifisert med flere pericytes markører. Vi sjekket for blodplate-avledet Vekstfaktorreseptor-β (PDGFR-β), som brukes som en klassisk markør av pericytes17, og for NG2 (Nevron-gliacellene antigen 2), som er en markør for pericyte mediert vaskulær morphogenesis22 og endometrial blodkar23. Vi har også sjekket for klynge av differensiering 146 (CD 146), som har blitt rapportert som en av molekylene uttrykt i pericytes17,18.
Her presenterer vi en protokoll for utvinning av primær pericytes fra mus (Wild type eller transgenics) som vil tilfredsstille alle de nevnte kravene med høy produksjon. Vi ansetter en antibiotika og immunopanning fritt valg-basert metode for spredning for den primære cerebral pericytes, som vil vise seg en effektiv modell for å gjennomføre in vitro studier.
Cerebral pericytes er en integrert del av NVU og spille en aktiv rolle i induksjon og vedlikehold av BBB24. På samme måte er rollen til disse cellene i de ulike nevrodegenerative lidelser og vaskulær patologi interessant. Derfor vil en effektiv høy produksjon primær pericyte celle modell gir en effektiv plattform for in vitro studier.
Det finnes ulike protokoller som er foreslått for isolering av primær pericytes (Figur 4). Tigges et al.17 foreslo en metode inkludert kortikale vev med hjernehinnene. Denne tilnærmingen er tenderering av vev fra 6 mus (en 37 ° c, 70 min fordøyelse med Papain/DNase enzymer) etterfulgt av en oppløsning trinn via 21 G og 18 G nåler. Denne protokollen antyder en ett-trinns separasjon (sentrifugering i 22% BSA/PBS-løsning) som gir minst 2 kollagen I belagt brønner av en 6-brønn plate. Cellene opprettholdes i endothelial cellevekst medium (ECGM) til passasje 3 og senere i pericyte vekstmedium (PGM) for passaging celler for å fremme pericyte spredning. I en annen lignende tilnærming, Chen et al.18 foreslått vev dissosiasjon ved dicing vevet med en sterilisert barberhøvel blad og vev fordøyelse med Kollagenase/DNase for 90 min ved 37 ° c. Etter ett-trinns separasjon (sentrifugering i 22% BSA) av cellene, blir det myelin laget fjernet og pellet er vasket to ganger i ECGM. Microårene er belagt i 3 brønner av et kollagen jeg belagt 6-brønn plater. Etter å ha nådd samløpet, er cellene passert to ganger og senere opprettholdt i PGM. Til slutt, hvis cellene er vedtatt i forhold til 3, kan vi få 27 brønner av 6-brønn plater bare ved bruk av 10 mus i begynnelsen av protokollen.
I Thomsen et al., forfatterne antyder isolering av cerebral pericytes via en to-trinns enzym fordøyelsen19. Hjernehinnene og hvit materie er fjernet, og hjerne prøver er skåret i små biter. Vevs bitene gjennomgår den første enzym reaksjonen i kollagenase/DNase i for 75 min ved 37 ° c, etter ett trinn i separasjon i 20% BSA. Pellet er samlet og videre fordøyd i kollagenase/dispase/DNase I for 50 min ved 37 ° c. Dette trinnet etterfølges av microvessel separasjon i en 33% Percoll gradient og videre vasket en gang. Microårene er sådd på kollagen IV/fibronektin belagt 35 mm retter. Spredningen av pericytes er foretrukket av 10% FCS og Gentamicin sulfat i DMEM i 10 dager. I en annen to-trinns enzym fordøyelsen tilnærming, Yamazaki et al. foreslå hakking av excised vev i kaldt DMEM20. I den første enzym reaksjonen behandles prøvene med kollagenase/DNase I for 75 min ved 37 ° c. Etter ett trinn sentrifugering, blir pellet igjen vasket en gang og en andre enzym reaksjon er igangsatt i kollagenase/dispase for 60 min ved 37 ° c. Etter en ett-trinns separasjon, er pellet resuspendert og sentrifugert i 22% BSA løsning. Endelig er mikrovaskulær pellet resuspendert og belagt i en 6-brønn plate. For 5 mus hjerner, 1 brønn av en 6-brønn plate kan være belagt. For å få pericytes, endothelial kulturer er passert tre ganger mens opprettholdt i mus hjernen endothelial celle (mBEC) medium II. Crouch og Doetsch20 foreslår pericyte rensing metoden ved FACS. Vevsprøver fra cortex og ventrikkel – subventricular sone av mus hjernen er dissekert og hakket grundig med en skalpell. Etter kollagenase/dispase enzym inkubasjons i 30 min ved 37 ° c, er fordøyd vevet adskilt fra myelin og rusk sentrifugert i en 22% v/v Percoll løsning. Celle fjæringen blir deretter inkubert i fluorescensmerkete bøyd antistoffer for FACS analyse og sortering. De sorterte cellene er belagt i kollagen belagte brønner av 24 brønn plate. Det er antydet at en cortex gir nok celler for en plating i 1 brønn av 24-brønn plate.
Selv om produktiv, disse metoder komme med adskillige begrensninger, fra bruken av høy antallet av dyrene for enkelt bakst isolasjon å en meget begrenset beløpet av produksjon.
Under utviklingen av denne foreslåtte protokollen, var vi lykkes i å oppnå høy produksjon: 9 brønner av en 6-brønn plate fra så få som 10 mus. For dette formål, fjerning av hjernehinnene sikrer ett trinn fjerning av store fartøy fra vevet. Den Dounce vev jeksel er mer hensiktsmessig for bløtvev som hjernen. Det sikrer også prøve reduksjon med den løse morter, homogenisering med den stramme morter, og forebygger unødvendig cellulær skade. En av de viktigste målene i primær cellekultur protokoller er minimalt avfall av vev og utvidet gjenfinning av cerebral blodkar. I den presenterte protokollen oppnås dette ved repeterende sentrifugering av dextran-BSA tilført vev homogenate. En tre-trinns sentrifugering tilnærming bidrar til å gjenopprette store mengder blodkar fra vevet homogenate. Dette gir en 3x forbedret gjenoppretting av microårene. Etter separasjon, filtrering er det neste viktige skritt, som favoriserer utelukkelse av glatt muskel celle forbundet store fartøy. Som nevnt før en kombinasjon av ulike enzymer har blitt foreslått for enzymatisk fordøyelse. Mens DNase og kollagenase/dispase brukes til å redusere klumper av celler og isolere enkeltceller henholdsvis, er det svært viktig å hindre celle død i et slikt invasiv miljø, og dette er forhindret av TLCK, som derved øker den endelige avkastningen. I utgangspunktet er den første passasjen lov til å vokse en endothelial monolag, som senere støtter veksten av vedlagte pericytes på unilayer. Siden overlevelsen av primær endothelial celler reduseres ved passaging, øker det sannsynligheten for pericyte gjenfinning. Videre bruker denne protokollen en annen passaging som sikrer unngåelse av endothelial celle forurensning. Det bør bemerkes at med et høyere antall celler fra P2, er avhengigheten av ytterligere passaging av cellene redusert. I tillegg reduserer det muligheten for pericyte vekst blir overkjørt av glatte muskelceller, som sprer på mye høyere rente.
For å oppnå en høyere produksjon, er det flere trinn som er kritiske og bør utføres nøyaktig med hensyn til temperatur og tid. Blandingen av vev som homogenate inn i BSA-dextran bør være rask. Pellet dissosiasjon etter sentrifugering trinnene bør være rask for å hindre celle død. Videre 33 min av enzymatisk fordøyelse bør gjøres med presisjon og omsorg. En av begrensningene for denne protokollen er den 7-8 dagen varighet som endothelial unilayer er lov til å vokse og ytterligere rette for vekst av pericytes. Tydeligvis er isolering av microårene btter, veksten av unilayer er raskere, og dermed er det et økende antall pericytes. Det anbefales ikke å bruke mindre enn 10 mus i hver ekstraksjon for å sikre et tilstrekkelig antall mikrovaskulær fraksjoner å støtte pericyte vekst ytterligere. Hvis de nevnte punktene følges nøye, ønsket celle tetthet for cerebral pericyte kultur kan enkelt oppnås.
In vitro-modeller gir en mulig plattform for utvikling av avledede modeller for å få mer informasjon om patofysiologiske relevans og kommunikasjon mellom de andre cellene i NVU under nevrologiske lidelser. Isolerte pericytes kan innlemmes i en bi-cellulær kultur (med endothelial eller gliacellene celler) og Tri-Cellular kultur (endothelial og gliacellene celler) modeller. Utviklingen av disse modellene har ikke vært diskutert her. For å konkludere, gir denne protokollen en tilnærming for isolering av primær celler med høyere produksjon og en bedre plattform for in vitro forskning knyttet til cerebral pericyte biologi.
The authors have nothing to disclose.
LT og FG ble innvilget av Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) innenfor rammen av EUs felles program – nevrodegenerative Disease Research (JPND) for prosjekt SNØBALL.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |