Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

Summary

En protokoll for generering av dynamiske kjemiske landskap etter fotolyse innenfor mikrofluidiske og millifluidiske oppsett presenteres. Denne metoden er egnet til å studere ulike biologiske prosesser, inkludert motilatferd, næringsopptak eller tilpasning til kjemikalier av mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsnivå.

Abstract

Vi demonstrerer en metode for generering av kontrollerte, dynamiske kjemiske pulser – der lokalisert kjemoattractant plutselig blir tilgjengelig på mikroskalaen – for å skape mikromiljøer for mikrobielle akserieeksperimenter. For å skape kjemiske pulser utviklet vi et system for å introdusere aminosyrekilder nær øyeblikkelig ved fotolyse av buraminosyrer i et mikrofluidant polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidisk kammer som inneholder en bakteriell suspensjon. Vi brukte denne metoden på kjemotaktisk bakterie, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kjemiske gradienter mens de spores av videomikroskopi. Aminosyrer, gjengitt biologisk inert (‘bur’) ved kjemisk modifikasjon med en fotoremovable beskyttende gruppe, er jevnt tilstede i suspensjonen, men ikke tilgjengelig for forbruk før deres plutselige utgivelse, som oppstår på brukerdefinerte punkter i tid og rom ved hjelp av en nær-UV-A fokusert LED-stråle. Antall molekyler som frigjøres i pulsen kan bestemmes av en kalibreringssammenheng mellom eksponeringstid og uncaging fraksjon, hvor absorpsjonsspekteret etter fotolyse er preget av bruk av UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polykarbonat (PCTE) membran kan integreres i mikrofluidisk enhet for å tillate kontinuerlig fjerning ved strømning av de uformede forbindelsene og de brukte mediene. Et sterkt, irreversibelt bånd mellom PCTE membranog PDMS mikrofluidisk struktur oppnås ved å dekke membranen med en løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) etterfulgt av plasmaaktivering av overflatene som skal bindes. Et datastyrt system kan generere brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter, for å skape ressurslandskap med foreskrevet romlig og tidsmessig variasjon. I hvert kjemisk landskap kan dynamikken i bakteriell bevegelse i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsnivå oppnås, og dermed tillate kvantifisering av kjemotaktisk ytelse og dens effekter på bakterielle aggregasjoner i økologisk relevante miljøer.

Introduction

Mikrober stole på chemotaxis, prosessen med å oppdage kjemiske gradienter og modifisere motilitet som svar¹, for å navigere kjemiske landskap, tilnærming næringskilder og verter, og unnslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprosessene bestemmer makroskaleretikken til interaksjoner mellom mikrober og deres miljø^2,3. Nylige fremskritt innen mikrofluidikk og mikrofabrikasjonsteknologier, inkludert myk litografi^4,har revolusjonert vår evne til å skape kontrollerte mikromiljøer der vi kan studere mikrober. For eksempel har tidligere eksperimenter studert bakteriell chemotaxis ved å generere svært kontrollerte, stabile gradienter av mellomliggende til høye næringskonsentrasjoner^5,6. Men i naturlige miljøer kan mikroskala kjemiske gradienter kortvarige – forsvant av molekylær diffusjon – og bakgrunnsforholdene er ofte svært fortynnede⁷. For å måle den kjemotaktiske responsen fra mikrobielle populasjoner som først ble utsatt for ustødige kjemiske miljøer, utviklet vi og her beskriver metoder for å kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse, og dermed etterligne gradienter som ville bakterier møter i naturen.

Uncaging teknologi benytter lysfølsomme sonder som funksjonelt innkapsle biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigjør burmolekylet, slik at målrettet perturbasjon av en biologisk prosess⁸. På grunn av den raske og presise kontrollen av cellulær kjemi som uncaging gir^9,har fotolyse av burforbindelser tradisjonelt vært ansatt av biologer, fysiologer og nevrologer for å studere aktivering av gener¹⁰, ion kanaler¹¹, og nevroner¹². Mer nylig har forskere utnyttet de betydelige fordelene med fotolyse for å studere chemotaxis¹³, for å bestemme flagella bytte dynamikken i individuelle bakterielle celler utsatt for en trinnvis kjemoattractant stimulus^14,15, og for å undersøke motilitetmønstre av enkelt sædceller i tredimensjonale (3D) gradienter¹⁶.

I vår tilnærming implementerer vi fotolyse av buraminosyrer i mikrofluidiske enheter for å studere atferdsresponsen til en bakteriell populasjon til kontrollerte kjemiske pulser, som blir nesten øyeblikkelig tilgjengelig gjennom fotoutgivelse. Bruk av et mål for lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gjør det mulig å både observasjonen av befolkningsnivået aggregativ respons av tusenvis av bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm), og måling av bevegelse på encellenivå. Vi presenterer to anvendelser av denne metoden: 1) utgivelsen av en enkelt kjemisk puls for å studere bakteriell akkumulering-spredningsdynamikk fra ensartede forhold, og 2i) frigjøring av flere pulser for å karakterisere bakterieakkumuleringsdynamikken under tidsvarierende, romlig heterogene kjemoattractantforhold. Denne metoden har blitt testet på de marine bakteriene Vibrio ordalii utfører chemotaxis mot aminosyreglutamat¹⁷, men metoden er bredt anvendelig for ulike kombinasjoner av arter og kjemoattractanter, samt til biologiske prosesser utover chemotaxis (f.eks næringsopptak, antibiotikaeksponering, quorumssensing). Denne tilnærmingen lover å bidra til å belyse økologiog oppførsel av mikroorganismer i realistiske miljøer og å avdekke de skjulte avveiningene som individuelle bakterier står overfor når du navigerer flyktige dynamiske gradienter.

Protocol

1. Fabrikasjon av mikrofluidisk enhet for enkelt kjemisk puls eksperiment Design kanalen ved hjelp av dataassistert design (CAD) programvare og skriv den ut på en gjennomsiktigfilm for å lage fotomasken (Figur 1A). Fremstille mesteren ved myk litografi (under rene rom). Rengjør en silisiumwafer (4 tommer) i rask rekkefølge med aceton, metanol og isopropanol, og tørk deretter ved hjelp av nitrogen. Stek waferen i ovnen ved 130 °C i 5 min.</li…

Representative Results

Vi brukte mikrofluidiske og millifluidiske enheter (figur 1) til å studere bakterielle akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsforhold. Bakterielle baner ble hentet fra innspilte videoer kjøpt av fasekontrastmikroskopi av akkumuleringsspredningsdynamikken til en bakteriell populasjon etter en kjemisk puls utgitt av fotolyse (figur 2 og figur 3). Ved å snitte millioner av baner ble den spatiotemporale dynamikken i radial dri…

Discussion

Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere bakteriell chemotaxis under kontrollerte, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidiske enheter, noe som muliggjør reproduserbar datainnsamling. Den nesten øyeblikkelige etableringen av kjemiske pulser på mikroskalaen ved fotolyse har som mål å reprodusere de typer næringspulser som bakterier møter i naturen fra en rekke kilder, for eksempel diffus spredning av plommer bak synkende marine partikler^25,eller næringsstoffet sprer seg fra…

Materials

(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material