En forsinket inokulasjonmodell av kroniskpseudomonas aeruginosa sårinfeksjon

Summary

Vi beskriver en forsinket inokulasjonsprotokoll for generering av kroniske sårinfeksjoner hos immunkompetente mus.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er et stort nosocomial patogen av økende relevans for menneskers helse og sykdom, spesielt i innstillingen av kroniske sårinfeksjoner hos diabetikere og innlagte pasienter. Det er et presserende behov for kroniske infeksjonsmodeller for å hjelpe til med undersøkelsen av sårpatogenogenese og utvikling av nye terapier mot dette patogenet. Her beskriver vi en protokoll som bruker forsinket inokulasjon 24 timer etter eksisjonssåret i full tykkelse. Infeksjonen i den provisoriske sårmatrisen som finnes på denne tiden skogaller enten rask clearance eller formidling av infeksjon og i stedet etablerer kronisk infeksjon som varer 7-10 dager uten behov for implantasjon av fremmedlegemer eller immunundertrykkelse. Denne protokollen etterligner et typisk timelig kurs av postoperativ infeksjon hos mennesker. Bruk av en selvlysende P. aeruginosa stamme (PAO1:lux) gir kvantitativ daglig vurdering av bakteriell byrde for P. aeruginosa sårinfeksjoner. Denne nye modellen kan være et nyttig verktøy i undersøkelsen av bakteriell patogenese og utvikling av nye terapier for kroniske P. aeruginosa sårinfeksjoner.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er en Gram-negativ stangformet bakterie med økende relevans for menneskers helse og sykdom. Det er ansvarlig for omfattende sykelighet og dødelighet i nosocomial-miljøer, spesielt med sårinfeksjoner hos immunkompromitterte pasienter^1,2. Fremveksten av multiresistente stammer av dette patogenet har gitt ytterligere drivkraft for undersøkelse av faktorer som bidrar til P. aeruginosa virulence, mekanismer for P. aeruginosa antibiotikaresistens, og nye metoder for forebygging og behandling av denne dødelige^{infeksjonen 3}. Som sådan har behovet for dyremodeller av kronisk sårinfeksjon som verktøy for å undersøke disse forskningsspørsmålene aldri vært større.

Dessverre har mange dyremodeller av P. aeruginosa infeksjon en tendens til å simulere akutt infeksjon med rask infeksjonsoppløsning eller rask nedgang på grunn av sepsis^4,5, som ikke tilstrekkelig simulerer ofte kronisk natur disse infeksjonene. For å løse denne ulempen, bruker noen modeller implantasjon av fremmedlegemer som agarperler, silikonimplantater eller alginatgeler^6,7,8. Andre modeller bruker mus som er immunkompromittert på grunn av avansert alder, fedme eller diabetes, eller gjennom farmakologiske midler som cyklofosfamidindusert nøytropeni^9,10,11,12. Imidlertid endrer enten bruk av fremmedlegemer eller immunkompromitterte verter sannsynligvis den lokale inflammatoriske prosessen, noe som gjør det vanskelig å få en forståelse av patofysiologien involvert i kroniske sårinfeksjoner hos verter med ellers normale immunsystem.

Vi har utviklet en kronisk modell av P. aeruginosa sårinfeksjon hos mus som innebærer forsinket inokulasjon med bakterier etter excisional såret. Forsinket inokulasjon gjør det mulig for eksperimenter som vurderer bakteriell byrde som strekker seg ut til minst 7 dager. Denne modellen åpner opp nye muligheter for å undersøke både patogenesen og nye behandlinger av P. aeruginosa kroniske infeksjoner.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stanford University. 1. Forberedelse og vekst av bakterier Gjennomføre alt arbeid med P. aeruginosa og dyr med BSL-2 forholdsregler i henhold til forskerens institusjonelle biosikkerhetskomité og retningslinjer for dyrebrukskomité. Gjør alle skritt som er beskrevet her som involverer P. aeruginosa, inkludert mus inokulasjon, i et biosikkerhetsskap. <li…

Representative Results

Ved hjelp av en selvlysende stamme av PAO1 med en plasmid koding av luxABCDE reportersystem (PAO1:lux), utførte vi excisional såret på mus, inokulerte disse sårene med planktononp 24 timer senere, og måltbakteriell byrde over tid (Figur 1 og figur 2). Et representativt bilde innhentet ved hjelp av et optisk bildesystem viser at denne modellen resulterer i påvisbar luminescens (figur 3…

Discussion

Vi har utviklet en ny forsinket inokulasjon P. aeruginosa sår infeksjon modell. Strategien om å forsinke inokulasjon med bakterier til 24 timer etter eksisional såret muliggjør evaluering av sårinfeksjoner over en 1-ukers tidsramme. Ved å bruke en selvlysende stamme av P. aeruginosa, er det mulig å spore infeksjonsprogresjon gjennom infeksjonskurset. Jo lenger infeksjonsforløpet sammenlignet med andre P. aeruginosa infeksjonsmodeller vil tillate nye muligheter for å studere host-patoge…

Materials

0.9% Sodium Chloride injection	Hospira	2484457
18 G x 1 sterile needle	BD	305195
25 G x 1 1/5 sterile needle	BD	305127
Alcohol swab	BD	326895
Aura Imaging Software	Spectral Instruments Imaging	n/a
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
Buprenorphine SR LAB	Zoopharm	n/a
C57BL/6J male mice	The Jackson Laboratory	000664
Disposable biopsy punch, 6mm	Integra	33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer	Harvard Apparatus	61-0183
Granulated Agar	Fisher BioReagents	BP9744
Heating Pad	Milliard	804879481218
Insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
Lago X Imaging System	Spectral Instruments Imaging	n/a
LB broth	Fisher BioReagents	BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe	BD	309628
Mini Arco Animal Trimmer	Wahl Professional	919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil	Church and Dwight	n/a	Available at any pharmacy
Octagon Forceps	Fine Science Tools	11041-08
Petri dish	Falcon	351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap	Glad	n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle	BD	305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Scale	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplical Nutritional Supplement	Henry Schein Animal Health	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W