आधुनिक फंगल सेल जीव विज्ञान में लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंग आवश्यक उपकरण हैं। यह पेपर प्लाज्मा झिल्ली गतिशीलता, एंडो/एक्सोसाइटोसिस और फिलामेंटल कवक में सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस पर नज़र रखने के लिए स्थापित और कम ज्ञात फ्लोरोसेंट रंगों के आवेदन का विवरण देता है।
कवक कोशिकाओं में ऑर्गेनेल गतिशीलता के लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का अनुप्रयोग दो दशक पहले शुरू हुआ था और तब से फिलामेंट्रस फंगल की हमारी समझ में बहुत योगदान देना जारी है जीवन शैली. यह पेपर दो झिल्ली रंगों एफएम 1-43 और एफएम 4-64 और चार सेल वॉल दाग Calcofluor व्हाइट M2R, सोलोफेनाइल फ्लेवाइन 7GFE 500, पोंटामाइन फास्ट स्कार्लेट 48 और कांगो रेड के उपयोग के लिए एक व्यावहारिक गाइड प्रदान करता है। ध्यान उनके कम खुराक आवेदन पर है कलाकृतियों मुक्त धुंधला, उनके सह इमेजिंग गुणों, और उनके मात्रात्मक मूल्यांकन का पता लगाने के लिए । प्रस्तुत किए गए तरीके सभी फिलामेंस फंगल नमूनों पर लागू होते हैं जिन्हें वर्णित तरीकों से तैयार किया जा सकता है। मौलिक धुंधला दृष्टिकोण प्रजातियों के लिए रूपांतरों के लिए शुरू अंक के रूप में काम कर सकते है कि विभिंन खेती की स्थिति की आवश्यकता हो सकती है । सबसे पहले, जैव भौतिक और जैव रासायनिक गुणों की समीक्षा की जाती है क्योंकि इन रंगों को वास्तव में महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट दाग के रूप में उपयोग करने के लिए उनकी समझ आवश्यक है। दूसरे, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं जो फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग के लिए विभिन्न फंगल नमूना प्रकारों की तैयारी का विस्तार करते हैं। अंत में, उदाहरण प्रयोग विभिन्न दृष्टिकोणों को दर्शाते हैं: (1) आनुवंशिक म्यूटेंट में एंडोसाइटोसिस के स्थानिक-लौकिक संगठन में दोषों की पहचान करें, (2) तुलनात्मक रूप से एफएफपी-लेबल वाले लक्ष्य प्रोटीन के साझा और विशिष्ट सह-स्थानीयकरण की विशेषता है एंडोसाइटिक मार्ग में, (3) एक आनुवंशिक उत्परिवर्ती में मॉर्फोजेनेटिक सेल दीवार दोषों की पहचान करता है, और (4) वास्तविक समय में सेल वॉल बायोजेनेसिस की निगरानी करता है।
बीस साल पहले, जिस तरह से हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस और अंतर्निहित आणविक कोशिका जीव विज्ञान को तंतु में कल्पना की जा सकती है, झिल्ली चयनात्मक फ्लोरोसेंट फी माओ दयो एफएम 4-641के आवेदन से क्रांतिकारी बदलाव किया गया था। बाद में, फंगल सेल वॉल डायनामिक्स के महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में चिटिन-बाइंडिंग डे कैल्कोफ्लोर व्हाइट का लाभ2का एहसास हुआ। तब से, दोनों रंगों और उसके वेरिएंट कवक में ऑर्गेनेल गतिशीलता के लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण का एक अंतर्निहित हिस्सा बन गए हैं, और फिलामेंटल फंगल जीवन शैली में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करना जारी रखते हैं। यह पेपर प्लाज्मा झिल्ली गतिशीलता, एंडो और एक्सोसाइटोसिस और फिलामेंटल कवक में सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस पर नज़र रखने के लिए स्थापित और कम ज्ञात फ्लोरोसेंट रंगों के आवेदन का विवरण देता है। एंडोसाइटोसिस ट्रैकिंग परखों से एंडोसाइटोसिस के सामान्य अध्ययन से संबंधित विभिन्न सेल जैविक प्रश्नों को संबोधित करने की अनुमति देता है। इसके लिए, एफएम डीवाई जोड़ पर दागडिब्बों के स्थानीयकरण, गति और उत्तराधिकार को परीक्षण कवक उपभेदों4के बीच की तुलना में समय चूक माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक रूप से दर्ज किया जाता है। सेल वॉल रंग कोशिका की बाहरी सीमा को चित्रित करते हैं और ध्रुवीकृत हाइफाल टिप ग्रोथ2,हाइफाल ब्रांचिंग5,हाइफाल फ्यूजन6,7 और पट निर्माण8सहित मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, वे स्थानीयकृत सेल दीवार जमाव और सेल वॉल बायोजेनेसिस9के दौरान दोषों की पहचान की मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं । क्योंकि किसी भी फ्लोरोसेंट मार्कर के जैव रासायनिक और जैव भौतिक गुणों का विस्तृत ज्ञान वीवो एप्लिकेशन में सफल होने के लिए एक मौलिक शर्त है, इन विशेषताओं को पहले इस लेख में चित्रित छह रंगों के लिए संक्षेप में संक्षेप में बताया गया है।
झिल्ली चुनिंदा रंग
एफएम (फी माओ) स्टाइलिल रंग छोटे एम्फीफिलिक अणु हैं जो जैविक झिल्ली10के लिपिड बाइलेयर के बाहरी पत्रक के साथ गुजर नहीं सकते हैं। वे जलीय समाधान में लगभग गैर-फ्लोरोसेंट हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली एकीकरण पर तीव्रता से फ्लोरोसेंट बन जाते हैं, जिससे उत्कृष्ट सिग्नल-टू-शोर (एस/एन)अनुपात11पैदा होता है। ये गुण उन्हें प्लाज्मा झिल्ली और इंट्रासेलुलर ऑर्गेनेल गतिशीलता की कल्पना करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल बनाते हैं, जिसमें एंडो और एक्सोसाइटोसिस12की ट्रैकिंग शामिल है। ग्रीन फ्लोरोसेंट एफएम 1-43 और लाल फ्लोरोसेंट एफएम 4-64 इन प्रयोजनों के लिए दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर हैं । SynaptoGreen C4 और SynaptoRed C2 वैकल्पिक आपूर्तिकर्ताओं से जेनेरिक अणु है कि एक दूसरे के बजाय एफएम 1-43 और एफएम 4-64, क्रमशः इस्तेमाल किया जा सकता है ।
स्टाइलिल रंगों में तीन प्रमुख संरचनात्मक क्षेत्र शामिल हैं: (1) लिपोफिलिक पूंछ जो लिपिड बाइलेयर में रंग के सम्मिलन की सुविधा प्रदान करती है, (2) फ्लोरोफोर कोर जो रंग के स्पेक्ट्रल गुणों को निर्धारित करता है और एक से तीन डबल बांड से जुड़े दो सुगंधित छल्ले द्वारा गठित किया जाता है, और (3) सकारात्मक आवेशित हाइड्रोफिलिक सिर जो झिल्ली(चित्रा 1ए)के माध्यम से रंग के पूर्ण सम्मिलन और परमीशन को रोकता है।
लिपोफिलिक पूंछ जितनी लंबी होगी, उतनी ही अधिक रंग की हाइड्रोफोबिसिटी होती है और इस प्रकार झिल्ली के लिए आत्मीयता बाध्यकारी होती है, लेकिन कम इसकी पानी की घुलनशीलता और झिल्ली डी-धुंधला दर होती है। नतीजतन, विभिन्न एफएम रंग वेरिएंट अलग धुंधला गतिशीलता और पैटर्न का उत्पादन। C4-पूंछ वाले एफएम 1-43 का उच्च हाइड्रोफोबिसिटी प्लाज्मा झिल्ली और आंतरिक ऑर्गेनेल्स पर एक मजबूत और अधिक स्थिर फ्लोरेसेंस संकेत प्रदान करता है, जब समानरूपर सांद्रता(चित्रा 2)पर लागू किया जाता है।
महत्वपूर्ण बात यह है कि दोनों एफएम रंगों की निरंतर और उच्च संघ/विसोशन दरें1-6 एस प्रति व्यक्तिगत रंग अणु13 के औसत प्रतिधारण समय के साथ झिल्ली के कार्य के स्थानीयव्यवधान के लिए संभावना को कम करती हैं, उदाहरण के लिए, झिल्ली तरलता के संशोधन या झिल्ली प्रोटीन की जबरन स्थायी बातचीत के माध्यम से । यह शायद महत्वपूर्ण कारण है कि इन अणुओं को महत्वपूर्ण रंगों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, 50 माइक्रोन से ऊपर एफएम रंग सांद्रता फंगल और पौधे की कोशिकाओं2,14के लिए विषाक्त हैं, और BY-2 तंबाकू प्रोटॉपस्ट से सबूत इंगित करता है कि 20 से अधिक μM एफएम डाया प्लाज्मा झिल्ली संतृप्ति14के लिए सीसा । इस प्रकार, इस सीमा से अधिक न होने की सलाह दी जाती है, विशेष रूप से इस तथ्य को देखते हुए कि उत्कृष्ट इमेजिंग को 2-5 माइक्रोएम15,16के साथ प्राप्त किया गया है।
विशेष रूप से, एफएम रंगों के स्पेक्ट्रल गुण विशेष झिल्ली माइक्रोएनवायरमेंट (समीक्षा किए गए14)के आधार पर बहुत भिन्न होते हैं। आम तौर पर, शुद्ध विलायक समाधानों में एफएम रंगों का उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (जैसा कि आमतौर पर उत्पाद जानकारी में प्रदान किया जाता है) सेलुलर वातावरण में उससे काफी भिन्न होता है और ज्यादातर मामलों में, लाइव-सेल इमेजिंग सेटिंग्स का चयन करने के लिए सीधे परामर्श नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एफएम 1-43 और एफएम 4-64 का उत्तेजना/उत्सर्जन मैक्सिमा क्रमशः 37/46 एनएम और 43/64 एनएम द्वारा नीला-स्थानांतरित हो जाता है, जब मेथनॉल(तालिका 1)में उनके समाधानों की तुलना में फंगल झिल्ली से बंधे होते हैं ।
स्पिटजेनकोपर और माइटोकॉन्ड्रिया सहित प्लाज्मा झिल्ली, एंडो-/एक्सोसाइटोसिस और ऑर्गेनेल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एफएम 4-64 और एफएम 1-43 के उपयोग के लिए जमीन तोड़ने वाले बुनियादी सिद्धांतों को पहले से ही2,4,17,18,19के लिए व्यापक रूप से प्रलेखित किया गया है । विभिन्न फिलामेंडफंगल प्रजातियों में काम करने वाले दोनों एफएम रंगों के लिए अनुशंसित इमेजिंग सेटिंग्स को चित्रा 1 Bमें चित्रित किया गया है। उपलब्ध उपकरणों या विशेष सेलुलर और प्रयोगात्मक स्थितियों की तकनीकी सीमाएं, जैसे संस्कृति माध्यम, पीएच या तापमान, हालांकि, कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सौभाग्य से, एफएम रंग एक विस्तृत स्पेक्ट्रल रेंज पर काम करते हैं, और बहुत अच्छे इमेजिंग परिणाम रोमांचक एफएम 1-43 द्वारा 514 एनएम या एफएम 4-64 के साथ 488 एनएम के साथ प्राप्त किए जाते हैं। नतीजतन, इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स प्रत्येक नमूना प्रकार और इच्छित आवेदन के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
एफएम 4-64 के 135 एनएम से अधिक के काफी स्टोक बदलाव से उत्कृष्ट, एक साथ सह-इमेजिंग की अनुमति मिलती है, फ्लोरोफोरस हरी रोशनी उत्सर्जित करते हैं; यह अक्सर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की इंट्रासेलर लोकलाइजेशन गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जाता है – प्लाज्मा झिल्ली और एंडोसाइटिक पाथवे9,20के सापेक्ष फ्यूजन प्रोटीन लेबल .
सेल वॉल-चयनात्मक रंग
कैल्कोफ्लोर व्हाइट M2R (CFW), भी फ्लोरोसेंट ब्राइटनर 28 के रूप में विपणन, शायद सबसे प्रसिद्ध फ्लोरोसेंट रंग बैक्टीरिया, कवक, शैवाल, उच्च पौधों और कीड़ों की कोशिका दीवारों दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । प्रारंभ में कागज, कपड़ा और डिटर्जेंट उद्योग में ऑप्टिकल व्हाइटनिंग एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है, फंगल संक्रमणों के नैदानिक निदान के लिए इसके लाभ21,22को जल्दी महसूस किए गए थे। क्योंकि सीएफडब्ल्यू नवजात चिटिन श्रृंखला में अपरिवर्तनीय रूप से विभाजित होजाता है , यह कोशिका दीवार बायोजेनेसिस के दौरान सामान्य चिटिन माइक्रोफिब्रिल असेंबली को परेशान करता है जिससे सेल वॉल स्ट्रेस23पैदा होता है । यह एक सेल दीवार क्षति मरम्मत तंत्र को ट्रिगर करता है जिससे ग्लूकन और चिटिन सिंथाज सक्रियण24,25के परिणामस्वरूप स्थानीय रूप से बढ़ गई सेल दीवार जमाव हो जाती है । यह घटना किसी भी रंग के साथ हो सकती है जो कोशिका दीवार पॉलिमर के लिए स्थिर रूप से बाध्यकारी द्वारा संचालित होती है, एकाग्रता पर निर्भर है और हाइवहल युक्तियों पर सबसे अधिक ध्यान देने योग्य है जो सबसे उर्वर बढ़ते हुए और इस प्रकार माइसेलियम(चित्रा 3)के सबसे संवेदनशील हिस्सों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिका दीवार क्षति का जवाब देने वाली आणविक मशीनरी का एक व्यापक सारांश हाल ही में26प्रदान किया गया है ।
फोटोटॉक्सिकिटी के साथ संयोजन में अधिक मात्रा में रंग हाइफाल डिब्बों(मूवी 1)के तेजी से सेल lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । फिर भी, जंगली प्रकार में “महत्वपूर्ण” रंगसांद्रता के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि का दोहन जीन हानि-कार्य म्यूटेंट9के सेल वॉल बायोसिंथेसिस में दोषों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। CFW और कांगो रेड (सीआर) के लिए, एक अन्य कपड़ा रंगक जिसे डायरेक्ट रेड 28 के रूप में भी जाना जाता है और कवक और कीड़ों के लिए α-और चिटिन-विशिष्ट सेल दीवार दाग के रूप में नियोजित किया गया है, जो27,28,दहलीज सांद्रता है जो ताइन सिंथाज़ को दृढ़ता से प्रेरित करता है और जीटी; क्रमशः 60 माइक्रोन सीएफडब्ल्यू और 70 माइक्रोन सीआर, जबकि सांद्रता और 15माइक्रोन या तो रंग ने फंगल विकास29,30,31को नहीं बदला या बाधित नहीं किया। हिक्की एट अल. 25 μM2पर CFW के लिए इस दहलीज एकाग्रता रखा । इसलिए, तनाव से संबंधित कलाकृतियों को बाहर करने और इन अणुओं का उपयोग वास्तव में “महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों”2,32के रूप में सुनिश्चित करने के लिए रंगसांत 5 μM का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। यह समान रूप से सोलोफेनाइल फ्लेवाइन 7GFE 500 (एसपीएफ) और पोंटामाइन फास्ट स्कार्लेट 4बी (पीएफएस) पर लागू होता है, जो क्रमशः प्रत्यक्ष पीले 86 और प्रत्यक्ष लाल 23 का पर्याय है, दो अन्य उपयोगी सेल वॉल रंगों, जिनकी कवक के लिए आवेदन पहली बार एक दशक से अधिक समय पहले33के लिए सूचित किया गया है। लेकिन उनके उल्लेखनीय स्पेक्ट्रल गुणों34,35के बावजूद तब से दोनों रंगों का उपयोग बहुत सीमित36,37रहा है . जैसा कि पहले 1.5 माइक्रोन सीएफडब्ल्यू2के लिए दिखाया गया था, 2 माइक्रोन एसपीएफ बहुत उच्च अस्थायी संकल्प(मूवी 2)के साथ देशी परिस्थितियों में सेल दीवार गतिशीलता को हल करने के लिए पर्याप्त हैं। यही परिणाम 2 माइक्रोन सीआर या पीएफएस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं।
साथ में, इन चार रंगों, CFW, एसपीयू, पीएफ, पीएफएस और सीआर, सेल वॉल-चुनिंदा फ्लोरोसेंट मार्कर का एक सेट शामिल है जो आधुनिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप(चित्रा 4)पर उपयोग किए जाने वाले लगभग पूर्ण दृश्यमान उत्सर्जन प्रकाश स्पेक्ट्रम (400-700 एनएम) को कवर करता है। सेल की दीवार बहुलक के लिए बाध्यकारी पर फ्लोरेसेंस तीव्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि सभी चार के लिए अंतर्निहित है और उत्कृष्ट एस/एन अनुपात उत्पन्न करता है । यह बदले में रंग सांद्रता रखने के लिए और प्रकाश तीव्रता बहुत कम उत्तेजना और सेल दीवार “कम खुराक” लाइव सेल इमेजिंग तकनीक2के रूप में धुंधला प्रदर्शन करने की अनुमति देता है । क्योंकि इन सेल दीवार रंगप्लाज झिल्ली अभेद्य हैं, वे एक साथ रहते है/ विशेष रूप से, उनके अत्यंत व्यापक उत्सर्जन प्रकाश स्पेक्ट्रा के कारण, अन्य फ्लोरोफोरस के साथ सीएफडब्ल्यू और एसपीएफ के सह-इमेजिंग गुणों के बारे में कुछ सीमाओं पर सावधानीपूर्वक विचार किए जाने की आवश्यकता है।
यह लेख जमीन तोड़ने का काम जारी है कि 2000 के दशककेशुरू में फिलामेंटल कवक के लिए महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल मार्कर के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग की स्थापना2,4,43,और एफएम रंगों और चयनित सेल दीवार रंगों के फोटोभौतिक और सेल जैविक गुणों पर चर्चा करने का प्रयास पहले की तुलना में अधिक विस्तार से। विशेष रूप से अवांछित सेलुलर प्रभावों के संबंध में, जैसे झिल्ली संतृप्ति या सेल दीवार क्षति, जो कुछ रंग सांद्रता से ऊपर होती हैं। क्या पहले सेलुलर स्तर पर गैर विषाक्त माना जाता है अब आणविक स्तर पर विषाक्त माना जाता है । हालांकि ये प्रभाव बहुत सूक्ष्म हो सकते हैं और ऑर्गेनेल या सेल व्यवहार में स्पष्ट परिवर्तनों से सीधे स्पष्ट नहीं हो सकते हैं, लेकिन दृश्य के अलावा अन्य रंग के आवेदन के किसी भी संभावित हस्तक्षेप को देशी आणविक कार्य की जांच के लिए कम किया जाना चाहिए। सौभाग्य से, सिलिकॉन हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टरों (एसआई-एपीडी)44 या एयरिकस्कैन क्षेत्र डिटेक्टर45जैसे आधुनिक डिटेक्टरों की बेहतर संवेदनशीलता और क्वांटम दक्षता, पहले की तुलना में कम रंग की मात्रा के उपयोग को सुविधाजनक बनाता है। लेख का एक अन्य प्रमुख उद्देश्य अन्य फ्लोरोफोरस के साथ इन रंगों के सह-इमेजिंग गुणों का उदाहरण देना है, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि जीव विज्ञान में सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में जीएफपी के लोग। यह इमेजिंग प्रयोगों के डिजाइन में सहायता करना चाहिए जिसका उद्देश्य फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की उप-सेलुलर स्थानीयकरण गतिशीलता को फंगल सेल दीवार, प्लाज्मा झिल्ली या एंडो-एंड एक्सोसाइटोसिस मार्ग आदि के लिए सहसंबंधित करना है।
प्राकृतिक और तनाव मुक्त स्थितियों के तहत इमेजिंग विश्वसनीय डेटा के अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति माध्यम और नमूना तैयारी के बारे में कुछ व्यावहारिक विचार इष्टतम शर्तों है कि कलाकृतियों मुक्त, स्वस्थ, उच्चतम एस/एन अनुपात के साथ तनावग्रस्त कोशिकाओं के लंबे समय अवलोकन किसी भी दिए गए नमूने के लिए संभव खोजने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने का लक्ष्य है । विश्वसनीय और सार्थक इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने का कोई सार्वभौमिक तरीका नहीं है। यह दृष्टिकोण के लिए अंतर्निहित है कि नमूना, व्यक्तिपरकता और माइक्रोस्कोपिस्ट की अपेक्षाओं की जैविक भिन्नता, साथ ही छवि पोस्ट प्रसंस्करण का क्रमशः डेटा अधिग्रहण और व्याख्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इसलिए, माइक्रोस्कोपिस्ट का व्यावहारिक अनुभव, जांच के तहत कवक के सेल जीव विज्ञान के बारे में उसका अंतरंग ज्ञान, साथ ही लैब सेटिंग में यथासंभव प्राकृतिक और अबाधित के रूप में स्थितियां बनाने के लिए कुशल नमूना तैयारी, इमेजिंग डेटा प्राप्त करने और मूल्यांकन करने के लिए सर्वोपरि है जो सच्चाई से अध्ययन की गई सेलुलर घटनाओं को दर्शाता है । अंगूठे के नियम के रूप में, फ्लोरोसेंट रंगों के अवांछित दुष्प्रभावों की घटना, सूक्ष्म से लेकर और इस प्रकार स्पष्ट रूप से प्लाज्मा झिल्ली या सेल दीवार की स्पष्ट रूप से दिखाई सक्रियता नहीं है, कोशिका ऑटोलिसिस के सरल साइटोटॉक्सिक प्रेरण के लिए तनाव प्रतिक्रिया रास्ते को फिर से मॉडलिंग करते हैं, केवल कम रंग की सांद्रता लागू करके सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है ।
फ्लोरोसेंट रंगों का आवेदन सरल है, फिर भी उनकी विशिष्टताओं की खराब विशेषता है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने की एक प्रमुख ताकत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की तैयारी सादगी है। कवक की खेती और नमूना, रंग (एस) के अलावा, और माइक्रोस्कोप चरण पर बढ़ते (अभ्यास के साथ) सीधा हैं। मूल इमेजिंग सेटिंग्स का समायोजन, जिसमें उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, एक्सपोजर टाइम, टाइम कोर्स सेटिंग्स आदि शामिल हैं, कोशिकाओं के अंदर इस्तेमाल किए गए फ्लोरोसेंट रंगों के माइक्रोस्कोप और जैविक नियमों के सरल बायोफिजिकल नियमों का पालन करते हैं। तालिका 1 प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त रंग या रंग संयोजन की पहचान का समर्थन करना चाहती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों की उचित कीमत होती है, जो भरोसेमंद उच्च गुणवत्ता के साथ आसानी से उपलब्ध होती है और इस प्रकार अत्यधिक प्रजनन योग्य अनुप्रयोग सुनिश्चित करती है।
झिल्ली या सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने के दो प्रमुख प्रतिबंध उनके सटीक धुंधला गुणों का (अक्सर) सीमित ज्ञान हैं, जो ज्यादातर मामलों में ऑर्गेनेल और आणविक स्तर पर गैर-विशिष्ट हैं, और उनकी एकाग्रता-निर्भर अवांछित दुष्प्रभाव हैं। एफएम रंग इंडो-और एक्सोसाइटोसिस में भाग लेने वाले लिपिड बाइलेयर के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, ठीक है जो उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स परीक्षण शर्तों के तहत क्रमिक रूप से लेबल हो जाते हैं, तुरंत स्पष्ट नहीं है और इसके लिए विभिन्न एफएम डी वेरिएंट की तुलना और अतिरिक्त ऑर्गेनेल-विशिष्ट मार्कर के साथ सह-लेबलिंग की आवश्यकता होती है। एफएम 4-64 की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के लिए एफएम 1-43 की वरीयता एक उदाहरण है। सेल वॉल चयनात्मक रंग कवक सेल दीवार के तीन प्रमुख बहुलकों के लिए अलग-अलग विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं। CFW को ग्लूकान और चिटिन के लिए एक गैर-विशिष्ट दाग माना जाता है, एसपीएफ को 1,4-ग्लूकान के लिए सबसे चयनात्मक माना जाता है, और सीआर को α-और-chitins के लिए अत्यधिक चयनात्मक माना जाता है। कवक सेल दीवार पॉलीसैकराइड ्समें पीएफएस की बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी वर्तमान में उपलब्ध नहीं है। जांच के तहत कवक प्रजातियों में दिए गए रंग की एकाग्रता पर किस अनुपात में कवक कोशिका दीवार बहुलक को सबसे प्रभावी ढंग से लेबल किया जाता है, आसानी से उत्तर नहीं दिया जाता है, और अन्य जीवों या अन्य फंगल प्रजातियों में विट्रो या वीवो में प्राप्त विस्तृत मापके आवेदन पर बहुत सावधानी पूर्वक विचार किया जाना चाहिए। दुर्भाग्य से, यह जानकारी35,42,46साहित्य में विरल और अत्यधिक बिखरी हुई है। अधिक हाल के रिकॉर्ड है कि पिछले अध्ययन ों पर पालन करेंगे३३ विशेष रूप से कवक में विशेष रुप से प्रदर्शित रंगों के सटीक धुंधला गुणों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं ।
धुंधला पैटर्न और सेलुलर प्रतिक्रियाओं का सही मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग नियंत्रण आवश्यक हैं। शायद सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है, हालांकि, कवक के सेल जीव विज्ञान को इतनी अच्छी तरह से जानना है कि झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में दर्ज परिवर्तन, सेलुलर वास्तुकला या हाइफाल विकास पैटर्न में परिवर्तन विशेष रूप से और आत्मविश्वास से प्रायोगिक उपचार के अभीष्ट प्रभावों से संबंधित हो सकते हैं। इसके लिए, किसी भी नए लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग के साथ अच्छे नियंत्रण होना महत्वपूर्ण है। इनमें अधिग्रहीत छवि से पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस और डिटेक्टर शोर को बाहर करने के लिए नकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण के रूप में अनुपचारित जंगली प्रकार शामिल हैं, और म्यूटेंट के साथ काम करते समय एक रूपात्मक तुलनात्मक होना शामिल है। इसके अलावा, एक सकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण, उदाहरण के लिए एक तनाव जो साइटोप्लाज्म या किसी अन्य प्रसिद्ध फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन में जीएफपी या आरएफपी को व्यक्त करता है, आवश्यक न्यूनतम उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को सेट करने और सेल जीवन शक्ति नियंत्रण रखने के लिए आवश्यक है। एक बार जब ये नियंत्रण सेट हो जाते हैं, तो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग केवल दृश्य कार्यों तक ही सीमित नहीं है, बल्कि उनकी एकाग्रता पर निर्भर धुंधला गतिशीलता, साथ ही एकाग्रता पर निर्भर दुष्प्रभावों का विश्लेषण किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, वास्तविक समय में सेल वॉल बायोसिंथेसिस की मात्रात्मक निगरानी के लिए या संवेदनशीलता परख47में उत्परिवर्ती-विशिष्ट फेनोटाइप की पहचान के लिए।
बेहतर भविष्य के अनुप्रयोग ों रंग धुंधला गुणों के एक विस्तृत कार्यात्मक विश्लेषण पर निर्भर करते हैं । एक प्रमुख सतत चुनौती क्वांतिटेटिव इमेज विश्लेषणों को और बेहतर बनाना और स्वचालित करना है ताकि तंतु कवक में झिल्ली और सेल वॉल चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों की उप-सेलुलर गतिशीलता के कार्यात्मक मूल्यांकन को आगे बढ़ाया जा सके। इसके लिए, विशेष परिवहन मार्गों में कमी वाले उत्परिवर्ती उपभेदों के संयोजन में ज्ञात ऑर्गेनेल और सेल वॉल बहुलक मार्कर के साथ इन रंगों के व्यापक, मात्रात्मक सह-स्थानीयकरण अध्ययनों की आवश्यकता होती है या जिनमें विशिष्ट संरचनात्मक घटकों की कमी होती है। एफएम रंगों के साथ तुलनात्मक विश्लेषण के लिए कई एंडोसाइटोसिस मार्कर48,49उपलब्ध हैं, और कवक में सेल वॉल रंगों की अभी भी खराब विशेषता बाध्यकारी विशिष्टताओं के संबंध में, फ्लोरोसेंट-लेबल ग्लूकन-विशिष्ट एंटीबॉडी50 का अनुप्रयोग इस मुद्दे को हल करने की संभावना प्रदान कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
धन्यवाद अल को अनुदान #256524 प्रदान करने के लिए टायरोलियन विज्ञान कोष (टीडब्ल्यूएफ) के कारण, वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF) को एसजेड को अनुदान #LS13-086 प्रदान करने के लिए, और ओपन एक्सेस प्रकाशन का समर्थन करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के प्रकाशन कोष के लिए है। लेखक ों ने लीका टीसीएस एसपी5 द्वितीय कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रदान करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के जूलॉजी विभाग को भी धन्यवाद दिया।
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |