Her presenterer vi en kompilert protokoll for å evaluere kutan infeksjon av mus med Leishmania amazonensis. Dette er en pålitelig metode for å studere parasittvirulens, noe som gir et systemisk syn på virveldyrvertens respons på infeksjonen.
Leishmania spp. er protozoiske parasitter som forårsaker leishmaniases, sykdommer som presenterer et bredt spekter av kliniske manifestasjoner fra kutane til viscerale lesjoner. For tiden er 12 millioner mennesker anslått å være smittet med Leishmania over hele verden og over 1 milliard mennesker lever i fare for infeksjon. Leishmania amazonensis er endemisk i Sentral- og Sør-Amerika og fører vanligvis til den kutane formen av sykdommen, som kan visualiseres direkte i en dyremodell. Derfor er L. amazonensis stammer gode modeller for kutan leishmaniasis studier fordi de er også lett dyrket in vitro. C57BL/6 mus etterligner L. amazonensis-drevetsykdomsprogresjon observert hos mennesker og regnes som en av de beste musstammermodellen for kutan leishmaniasis. I virveldyrverten bor disse parasittene makrofager til tross for forsvarsmekanismene til disse cellene. Flere studier bruker in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere parasitten infectivity under ulike forhold. In vitro-tilnærmingen er imidlertid begrenset til et isolert cellesystem som ser bort fra organismens respons. Her utarbeider vi en in vivo murine infeksjonsmetode som gir en systemisk fysiologisk oversikt over vertsparasittinteraksjonen. Den detaljerte protokollen for in vivo-infeksjonen av C57BL/6 mus med L. amazonensis består av parasittdifferensiering i infeksiøse amastigoter, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjonsutvikling og parasittbelastningsbestemmelse. Vi foreslår denne veletablerte metoden som den mest tilstrekkelige metoden for fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons er på kutan leishmaniasis.
Leishmaniases er verdensomspennende utbredtparasittiske smittsomme sykdommer som representerer viktige utfordringer i utviklingsland og er anerkjent som en av de viktigste forsømte tropiske sykdommene av Verdens helseorganisasjon1,2. Leishmaniases er preget av kutan, slimhinne, og / eller visceral manifestasjoner. Kutan leishmaniasis er vanligvis forårsaket av L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica og L. aethiopica3. Denne sykdomsformen er ofte selvhelbredende hos mennesker på grunn av induksjon av beskyttende cellulær immunrespons. Imidlertid kan den cellulære immunresponsen mislykkes, og sykdommen kan utvikle seg til spredt kutan leishmaniasis4,5. Det er ingen tilgjengelig vaksine på grunn av mangfoldet blant Leishmania arter og vert genetisk bakgrunn6,7. Behandlingstilbud er også begrenset som de fleste av de tilgjengelige stoffene er enten dyre, giftige, og / eller kan kreve langsiktig behandling8,9. Dessuten har det vært rapporter om resistens mot tilgjengelige behandlinger10,11.
Den forårsakende agenten til leishmaniases er den protozoiske parasitten Leishmania. Parasitten presenterer to distinkte morfologiske former i livssyklusen: promastigotes, den flagellated form funnet i sandfluer; og amastigotes, den intracellulære formen som finnes i parasitophorous vacuoles av pattedyr vert makrofager12,13. Amastigotes evne til å invadere, overleve og replikere til tross for forsvarsmekanismene til virveldyrvertens makrofager er underlagt mange studier14,15,16,17. Derfor har flere forskningsgrupper beskrevet in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere virkningen av spesifikke miljøfaktorer, samt parasitt og vert gener på parasitt ensmittivitet. Denne analysen presenterer flere fordeler, for eksempel evnen til å tilpasse studier til et høyt gjennomstrømningsformat, relativt kortere tidsperiode for å oppnå resultater, og redusert antall laboratoriedyr ofret18. Men funnene av in vitro analyser er begrenset fordi de ikke alltid replikere in vivo studier14,19,20,21. In vivo assays gir en systemisk fysiologisk oversikt over host-parasittinteraksjonen, som ikke kan etterlignes fullt ut av in vitro-analyser. For eksempel kan immunologiske studier utføres gjennom immunohistokjemiske analyser fra innsamlede fotputevevseksjoner eller til og med fra popliteale lymfeknuter for analyse av de gjenopprettede immuncellene22.
Dyr brukes ofte som modell for menneskelige sykdommer i biologisk og biomedisinsk forskning for å bedre forstå de underliggende fysiologiske mekanismene til sykdommene23. I tilfelle av leishmaniasis, påvirker ruten, stedet eller dosen av inokulasjon sykdomsutfallet24,25,26,27. Videre er mottakelighet og motstand mot infeksjonen hos mennesker og mus sterkt regulert av den genetiske bakgrunnen til verten og parasitten4,5,22,28,29,30,31. BALB/c-mus er svært utsatt for L. amazonensis kutan infeksjon, som viser en rask sykdomsprogresjon med parasittenes spredning til lymfeknuter, milt og lever32. Ettersom sykdommen kan utvikle seg til kutane metastaser, kan infeksjonen være dødelig. I motsetning utvikler C57BL/6 mus ofte kroniske lesjoner med vedvarende parasittbelastning i L. amazonensisinfeksjonsanalyser 33. Dermed har L. amazonensisinfeksjon med denne spesielle musearten blitt ansett som en utmerket modell for å studere kroniske former for kutan leishmaniasis hos mennesker, fordi den etterligner sykdomsprogresjonen bedre enn BALB / c mus infeksjonmodell5,34.
Derfor foreslår vi at murine in vivo infeksjon er en nyttig metode for Leishmania virulence fysiologiske studier som gjelder for menneskelig sykdom, slik at et systemisk syn på vertsparasittinteraksjonen. Revisiting veletablerte analyser22, presenterer vi her en kompilert trinnvis protokoll av in vivo infeksjon av C57BL/6 mus med L. amazonensis som består parasittdifferensiering i axenic amastigotes, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjon utvikling, og parasitt last bestemmelse. Denne protokollen kan tilpasses andre mus stammer og Leishmania arter som forårsaker kutane leishmaniases. Til slutt er metoden som presenteres her avgjørende for å identifisere nyeanti-Leishmania narkotikamål og vaksiner, samt i fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons på Leishmania-infeksjon.
In vivo infeksjon analyse beskrevet i denne protokollen tillater enhver forsker å evaluere in vivo kutan leishmaniasis vurderer verten-parasitt interaksjon i et systemisk scenario. Disse analysene har blitt brukt av mange grupper22,24,27,29,31,32,34,49 og …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara fra Animal Center of the Biomedical Sciences Institute ved Universitetet i São Paulo for støtte og prof. Dr. Silvia Reni Uliana for å gi glassvevsliperen. Dette arbeidet ble støttet av Sao Paulo Research Foundation (FAPESP – MFLS’ stipend 2017/23933-3).
96-well plate | Greiner bio-ne | 655180 | A flat-bottom plate for limiting dilution assay |
adenine | Sigma | A8626 | Supplement added to M199 cell culture media |
caliper | Mitutoyo | 700-118-20 | A caliper to measure the thickness of footpad |
cell culture flask | Corning | 353014 | A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite |
centrifuge | Eppendorf | 5804R | An equipament used for separating samples based on its density |
CO2 incubator 34 °C | Thermo Scientific | 3110 | An incubator for amastigotes differentiation |
ethanol | Merck | K50237083820 | A disinfectant for general items |
fetal bovine serum | Gibco | 12657-029 | Supplement added to M199 cell culture media |
glass tissue grinder tube | Thomas Scientific | 3431 E04 | A tube to collect and disrupt infected footpad tissue |
glucose | Synth | G1008.01.AH | Supplement added to M199 cell culture media |
GraphPad Prism Software | GraphPad | A software used to plot the data and calculate statistical significance | |
hemin | Sigma | H-2250 | Supplement added to M199 cell culture media |
HEPES | Promega | H5303 | Supplement added to M199 cell culture media |
incubator 25 °C | Fanem | 347CD | An incubator for promastigotes cultivation |
inverted microscope | Nikon | TMS | An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures |
isoflurane | An inhalant anesthetics for mice (3-5%) | ||
laminar flow cabinet | Veco | VLFS-09 | A biosafety cabinet used for aseptical work area |
M199 cell culture media | Gibco | 31100-035 | A cell culture media for Leishmania cultivation |
microcentrifuge tube | Axygen | MCT150C | A microtube used for sample collection, processing and storage |
multichanel pipette | Labsystems | F61978 | A multichannel pipette used for limiting dilution assay |
NaHCO3 | Merck | 6329 | Supplement added to M199 cell culture media |
NaOH | Sigma | S8045 | Supplement added to M199 cell culture media |
Neubauer chamber | HBG | 2266 | A hemocytometer to count the parasite suspension |
optical microscope | Nikon | E200 | An optical equipament used to count parasite |
parafilm | Bemis | 349 | A flexible and resistant plastic to seal the plate |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Supplement added to M199 cell culture media |
Petri dishes | TPP | 93100 | A sterile dish to dissect the footpad tissue |
pipetman kit | Gilson | F167360 | A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000) |
scale | Quimis | BG2000 | An equipament used to weigh collected footpad lesions |
scalpel | Solidor | 10237580026 | A scalpel to cut and collect footpad tissue |
serological pipette 10 mL | Nest | 327001 | A sterile pipette used for transfering mililiter volumes |
tips | Axygen | A pipette tip used for transfering microliter volumes | |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | A dye used to count viable parasites |
trypticase peptone | Merck | Supplement added to M199 cell culture media | |
tuberculin syringe | BD | 305945 | A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension |