In Vivo Infeksjon med Leishmania amazonensis å evaluere parasitt virulens hos mus

Summary

Her presenterer vi en kompilert protokoll for å evaluere kutan infeksjon av mus med Leishmania amazonensis. Dette er en pålitelig metode for å studere parasittvirulens, noe som gir et systemisk syn på virveldyrvertens respons på infeksjonen.

Abstract

Leishmania spp. er protozoiske parasitter som forårsaker leishmaniases, sykdommer som presenterer et bredt spekter av kliniske manifestasjoner fra kutane til viscerale lesjoner. For tiden er 12 millioner mennesker anslått å være smittet med Leishmania over hele verden og over 1 milliard mennesker lever i fare for infeksjon. Leishmania amazonensis er endemisk i Sentral- og Sør-Amerika og fører vanligvis til den kutane formen av sykdommen, som kan visualiseres direkte i en dyremodell. Derfor er L. amazonensis stammer gode modeller for kutan leishmaniasis studier fordi de er også lett dyrket in vitro. C57BL/6 mus etterligner L. amazonensis-drevetsykdomsprogresjon observert hos mennesker og regnes som en av de beste musstammermodellen for kutan leishmaniasis. I virveldyrverten bor disse parasittene makrofager til tross for forsvarsmekanismene til disse cellene. Flere studier bruker in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere parasitten infectivity under ulike forhold. In vitro-tilnærmingen er imidlertid begrenset til et isolert cellesystem som ser bort fra organismens respons. Her utarbeider vi en in vivo murine infeksjonsmetode som gir en systemisk fysiologisk oversikt over vertsparasittinteraksjonen. Den detaljerte protokollen for in vivo-infeksjonen av C57BL/6 mus med L. amazonensis består av parasittdifferensiering i infeksiøse amastigoter, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjonsutvikling og parasittbelastningsbestemmelse. Vi foreslår denne veletablerte metoden som den mest tilstrekkelige metoden for fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons er på kutan leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases er verdensomspennende utbredtparasittiske smittsomme sykdommer som representerer viktige utfordringer i utviklingsland og er anerkjent som en av de viktigste forsømte tropiske sykdommene av Verdens helseorganisasjon^1,2. Leishmaniases er preget av kutan, slimhinne, og / eller visceral manifestasjoner. Kutan leishmaniasis er vanligvis forårsaket av L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica og L. aethiopica³. Denne sykdomsformen er ofte selvhelbredende hos mennesker på grunn av induksjon av beskyttende cellulær immunrespons. Imidlertid kan den cellulære immunresponsen mislykkes, og sykdommen kan utvikle seg til spredt kutan leishmaniasis^4,5. Det er ingen tilgjengelig vaksine på grunn av mangfoldet blant Leishmania arter og vert genetisk bakgrunn^6,7. Behandlingstilbud er også begrenset som de fleste av de tilgjengelige stoffene er enten dyre, giftige, og / eller kan kreve langsiktig behandling^8,9. Dessuten har det vært rapporter om resistens mot tilgjengelige behandlinger^10,11.

Den forårsakende agenten til leishmaniases er den protozoiske parasitten Leishmania. Parasitten presenterer to distinkte morfologiske former i livssyklusen: promastigotes, den flagellated form funnet i sandfluer; og amastigotes, den intracellulære formen som finnes i parasitophorous vacuoles av pattedyr vert makrofager^12,13. Amastigotes evne til å invadere, overleve og replikere til tross for forsvarsmekanismene til virveldyrvertens makrofager er underlagt mange studier^14,15,16,17. Derfor har flere forskningsgrupper beskrevet in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere virkningen av spesifikke miljøfaktorer, samt parasitt og vert gener på parasitt ensmittivitet. Denne analysen presenterer flere fordeler, for eksempel evnen til å tilpasse studier til et høyt gjennomstrømningsformat, relativt kortere tidsperiode for å oppnå resultater, og redusert antall laboratoriedyr ofret¹⁸. Men funnene av in vitro analyser er begrenset fordi de ikke alltid replikere in vivo studier^14,19,20,21. In vivo assays gir en systemisk fysiologisk oversikt over host-parasittinteraksjonen, som ikke kan etterlignes fullt ut av in vitro-analyser. For eksempel kan immunologiske studier utføres gjennom immunohistokjemiske analyser fra innsamlede fotputevevseksjoner eller til og med fra popliteale lymfeknuter for analyse av de gjenopprettede immuncellene²².

Dyr brukes ofte som modell for menneskelige sykdommer i biologisk og biomedisinsk forskning for å bedre forstå de underliggende fysiologiske mekanismene til sykdommene²³. I tilfelle av leishmaniasis, påvirker ruten, stedet eller dosen av inokulasjon sykdomsutfallet^24,25,26,27. Videre er mottakelighet og motstand mot infeksjonen hos mennesker og mus sterkt regulert av den genetiske bakgrunnen til verten og parasitten^{4,5,22,28,29,30,31}. BALB/c-mus er svært utsatt for L. amazonensis kutan infeksjon, som viser en rask sykdomsprogresjon med parasittenes spredning til lymfeknuter, milt og lever³². Ettersom sykdommen kan utvikle seg til kutane metastaser, kan infeksjonen være dødelig. I motsetning utvikler C57BL/6 mus ofte kroniske lesjoner med vedvarende parasittbelastning i L. amazonensisinfeksjonsanalyser ³³. Dermed har L. amazonensisinfeksjon med denne spesielle musearten blitt ansett som en utmerket modell for å studere kroniske former for kutan leishmaniasis hos mennesker, fordi den etterligner sykdomsprogresjonen bedre enn BALB / c mus infeksjonmodell^5,34.

Derfor foreslår vi at murine in vivo infeksjon er en nyttig metode for Leishmania virulence fysiologiske studier som gjelder for menneskelig sykdom, slik at et systemisk syn på vertsparasittinteraksjonen. Revisiting veletablerte analyser²², presenterer vi her en kompilert trinnvis protokoll av in vivo infeksjon av C57BL/6 mus med L. amazonensis som består parasittdifferensiering i axenic amastigotes, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjon utvikling, og parasitt last bestemmelse. Denne protokollen kan tilpasses andre mus stammer og Leishmania arter som forårsaker kutane leishmaniases. Til slutt er metoden som presenteres her avgjørende for å identifisere nyeanti-Leishmania narkotikamål og vaksiner, samt i fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons på Leishmania-infeksjon.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Institute of Bioscience ved Universitetet i São Paulo (CEUA 342/2019), og ble gjennomført i samsvar med anbefalingene og retningslinjene for omsorg og bruk av laboratoriedyr i São Paulo State (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) og den brasilianske regjeringen (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle trinn som er beskrevet i avsnitt 1-5 bør utføres aseptisk inne i lamimerstrømningsskap. Personlig verneutstyr bør benyttes mens du hå…

Representative Results

Leishmania protozoan parasitter finnes i to utviklingsformer i løpet av livssyklusen i virvelløse og virvelløse verter: promastigotes, de proliferative formene som finnes i lumen av den kvinnelige sandfluen; og amastigotes, de proliferative former som finnes i parasitophorous vacuoles av pattedyr vertsceller. Promastigotes har en langstrakt kropp på ca. 1,5 μm bred og 20 μm lang, med et flagellum som vanligvis kommer fra fremre ekstremitet. Amastigotes har en avrundet eller…

Discussion

In vivo infeksjon analyse beskrevet i denne protokollen tillater enhver forsker å evaluere in vivo kutan leishmaniasis vurderer verten-parasitt interaksjon i et systemisk scenario. Disse analysene har blitt brukt av mange grupper^{22,24,27,29,31,32,34,49} og …

Materials

96-well plate	Greiner bio-ne	655180	A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine	Sigma	A8626	Supplement added to M199 cell culture media
caliper	Mitutoyo	700-118-20	A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask	Corning	353014	A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge	Eppendorf	5804R	An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C	Thermo Scientific	3110	An incubator for amastigotes differentiation
ethanol	Merck	K50237083820	A disinfectant for general items
fetal bovine serum	Gibco	12657-029	Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube	Thomas Scientific	3431 E04	A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose	Synth	G1008.01.AH	Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software	GraphPad		A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin	Sigma	H-2250	Supplement added to M199 cell culture media
HEPES	Promega	H5303	Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C	Fanem	347CD	An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope	Nikon	TMS	An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane			An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet	Veco	VLFS-09	A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media	Gibco	31100-035	A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT150C	A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette	Labsystems	F61978	A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3	Merck	6329	Supplement added to M199 cell culture media
NaOH	Sigma	S8045	Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber	HBG	2266	A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope	Nikon	E200	An optical equipament used to count parasite
parafilm	Bemis	349	A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes	TPP	93100	A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit	Gilson	F167360	A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale	Quimis	BG2000	An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel	Solidor	10237580026	A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL	Nest	327001	A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips	Axygen		A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue	Gibco	15250-061	A dye used to count viable parasites
trypticase peptone	Merck		Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe	BD	305945	A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension