Summary

الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

هنا نقدم طريقه الفرز لبيروفوسفاتاسي الغشائية (من Thermotoga maritima) مثبطات استنادا إلى رد فعل الموليبدينوم الأزرق في شكل لوحه بشكل جيد 96.

Abstract

الاغشيه البركانية المرتبطة بالغشاء (mPPases) هي انزيمات ديميريكه تحدث في البكتيريا والنباتات والطفيليات. هذه البروتينات يلتصق بيروفوسفات في اثنين من جزيئات مقوم العظام, الذي يقترن مع البروتون و/أو أيون الصوديوم ضخ عبر الغشاء. منذ لا تحدث البروتينات المتماثلة في الكائنات والبشر ، mPPases هي المرشحين جيده في تصميم أهداف المخدرات المحتملة. هنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص مثبطات mPPase باستخدام تفاعل الأزرق الموليبدينوم في 96 نظام لوحه جيدا. نحن نستخدم mPPase من بكتيريا thermophilic Thermotoga ماريتيما (tmppase) كانزيم نموذج. هذا البروتوكول بسيطه وغير مكلفه ، وتنتج نتيجة متسقة وقويه. يستغرق الأمر حوالي ساعة واحده فقط لإكمال بروتوكول فحص النشاط من بداية الفحص حتى قياس الامتصاص. وبما ان اللون الأزرق المنتج في هذا الفحص مستقر لفتره طويلة من الزمن ، يمكن اجراء المقايسة اللاحقة مباشره بعد الدفعة السابقة ، ويمكن قياس الامتصاص في وقت لاحق لجميع الدفعات دفعه واحده. العيب في هذا البروتوكول هو ان يتم ذلك يدويا ، التالي يمكن ان تكون مرهقه ، فضلا عن تتطلب مهارات جيده من التنضيد وحفظ الوقت. وعلاوة علي ذلك ، فان محلول ارسينيت سيترات المستخدم في هذا الفحص يحتوي علي ارسينيت الصوديوم ، وهو سام وينبغي التعامل معه بالاحتياطات اللازمة.

Introduction

ما يقرب من 25 ٪ من مجموع البروتينات الخلوية هي البروتينات غشاء وحوالي 60 ٪ منهم المخدرات الأهداف1،2. واحده من الأهداف المخدرات المحتملة3, الغشاء المتجهة بيروفوسفواسات (mppases), هي الانزيمات الديميريكه التي ضخ البروتون و/أو أيون الصوديوم عبر الغشاء عن طريق التحلل من بيروفوسفات في اثنين من تقويم العظام4. ويمكن العثور علي mPPases في الكائنات الحية المختلفة5 مثل البكتيريا ، والنباتات ، والطفيليات التقدمية ، باستثناء البشر والحيوانية4. في الطفيليات التقدمية ، علي سبيل المثال منجلي البلازما ، الغدد التناسلية الطفيلية والمكورات الفطرية، mppases ضرورية لطفيل الطفيليات6 والضربة القاضية لهذا التعبير في الطفيليات تؤدي إلى الفشل في الحفاظ علي درجه الحموضة داخل الخلايا عند التعرض لph الأساسي الخارجي7. نظرا لأهميتها وعدم وجود البروتين المتماثل الموجودة في الفقاريات ، ويمكن اعتبار mPPases كاهداف المخدرات المحتملة للامراض protistal3.

ويستند الفحص في المختبر من مثبطات mPPase في هذا العمل علي نظام نموذج TmPPase. TmPPase هو ضخ أيون الصوديوم وأيون البوتاسيوم تعتمد mPPase من t. maritima ولها النشاط الأمثل في 71 درجه مئوية8. فوائد هذا الانزيم هي علي سبيل المثال سهوله في الإنتاج والتنقية ، والاستقرار الحراري الجيد والنشاط النوعي العالي. ويظهر tmppase كلا من التشابه العالي بالاضافه إلى الحفظ الكامل للموقف ، فضلا عن هويه جميع البقايا الحفازه للبروست mppases3،9 والي هيكل محلوله من فيجنا رادياتا10 mppases. الهياكل المتاحة من TmPPase في التشكيلات المختلفة هي أيضا مفيده لتجربه تصميم المخدرات علي أساس الهيكل (كما الفحص الظاهري وتصميم دي نوفو).

هنا نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول مفصل لفحص مثبطات TmPPase في شكل لوحه بشكل جيد 96 (الشكل 1). ويستند البروتوكول علي الأسلوب اللوني للتفاعل الأزرق الموليبدينوم ، الذي وضعت لأول مره من قبل فيش و Subbarow11. يتضمن هذا أسلوب التشكيل من [12-فوسموولبديك] حامض من [ثونوفوسفات] و موليبدات تحت شروط حامضيه, اي يكون بعد ذلك قللت ان يعطي مميزه [بلو-لون] فوسفوموليبدينوم نوع12.

Protocol

1. اعداد البروتين ملاحظه: تم وصف التعبير وتنقيه TmPPase في مكان آخر13. اعداد 10 مل من حل أعاده التنشيط العازلة التي تحتوي علي 20 مم 2-(ن-مورتولينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) pH 6.5 ، 3.5 ٪ (v/v) الجلسرين ، 2 مم ديثيوثريتول (dtt) ، و 0.05 ٪ دوديسيل مالتوسيدي (DDM). اعداد 10 مل من…

Representative Results

وفي هذا البروتوكول ، تم اختبار ثماني مركبات (1 − 8) (الشكل 2 ا) مع المشردين داخليا ، وهو مثبط شائع للفوسفازات البركانية ، كعنصر تحكم إيجابي. تم اختبار كل مجمع في ثلاثه تركيزات مختلفه (1 μM ، 5 μM و 20 μM) في ثلاثي النسخ. ويصور سير العمل في الفحص في الشكل 1، بدءا من اعدا…

Discussion

هنا نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل لفحص بسيط من مثبطات لبيروفوسفاتاسي الغشاء المرتبطة من t. maritima في شكل لوحه جيدا 96 استنادا إلى Vidilaseris وآخرون14. هذا البروتوكول غير مكلفه واستنادا إلى حمض 12 فوسفوميوليبديك ، الذي يتكون من الفوسفات والموليبدات في ظل الظروف الحمضية وخفضت إلى فو?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من مؤسسه جين واياتوس ايركو و BBSRC (BB/M021610) إلى أدريان غولدمان ، اكاديميه فنلندا (رقم 308105) إلى كيني فيدياسريس ، (رقم 310297) إلى هنري اكسارد ، و (رقم 265481) إلى جاري لي-كاوهالوما ، واليي جامعه هلسنكي للبحوث المالية إلى غوستاف بويجي اف جينناس (). ويشكر المؤلفون برناديت جهل علي مساعدتها الفنية خلال المشروع.

Materials

Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).

Play Video

Cite This Article
Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

View Video