Denne protokollen beskriver kirurgisk generering av orthotopic bukspyttkjertel svulster og rask fordøyelse av fersk isolert murine bukspyttkjertel svulster. Etter fordøyelsen, kan levedyktige immun celle populasjoner brukes til videre nedstrøms analyse, inkludert ex vivo stimulering av T-celler for intracellulære cytokin deteksjon ved flyt flowcytometri.
In vivo modeller av kreft i bukspyttkjertelen gir uvurderlig verktøy for å studere sykdom dynamikk, uimottakelig infiltrasjon og nye terapeutiske strategier. Den orthotopic murine modellen kan utføres på store kohorter av immunkompetente mus samtidig, er relativt billig og bevarer beslektet vevet mikromiljøet. Den kvantifisering av T celle infiltrasjon og cytotoksisk aktivitet innen orthotopic svulster gir en nyttig indikator på en antitumoral respons.
Denne protokollen beskriver metodikken for kirurgisk generering av orthotopic bukspyttkjertelen svulster ved injeksjon av et lavt antall syngeneic tumorceller resuspendert i 5 μL kjeller membran direkte inn i bukspyttkjertelen. Mus peiling orthotopic svulster ta ca 30 dager å nå endepunktet, på hvilket tidspunkt svulster kan høstes og behandles for karakterisering av tumor-infiltrere T celle aktivitet. Rapid enzymatisk fordøyelsen bruker kollagenase og DNase tillater en enkelt celle suspensjon å bli Hentet fra svulster. Levedyktigheten og celleoverflaten markører for immunceller utvunnet fra svulsten er bevart; Derfor er det hensiktsmessig for flere nedstrøms applikasjoner, inkludert Flow-assistert celle sortering av immunceller for kultur eller RNA utvinning, flyt flowcytometri analyse av immun celle populasjoner. Her beskriver vi ex vivo stimulering av T celle populasjoner for intracellulære cytokin kvantifisering (IFNγ og TNFα) og degranulering aktivitet (CD107a) som et mål på total cytotoksisitet. Hel svulst fordøyer ble stimulert med phorbol isopropylmyristat acetate og ionomycin for 5 h, i nærvær av anti-CD107a antistoff for å upregulate cytokin produksjon og degranulering. Tillegg av brefeldin A og monensin for den siste 4 h ble utført for å blokkere ekstracellulære transport og maksimere cytokin deteksjon. Ekstra-og intra-Cellular farging av celler ble deretter utført for Flow flowcytometri analyse, der andelen IFNγ+, TNFα+ og CD107a+ CD4+ og CD8+ T celler ble kvantifisert.
Denne metoden gir et utgangspunkt for å utføre omfattende analyse av tumor mikromiljøet.
Denne metoden detaljer, fra Start-til-avslutning, den kirurgiske prosedyren for generering av orthotopic bukspyttkjertel svulster ved hjelp av en minimal mengde av cellulære materiale og den påfølgende raske dissosiasjon av etablerte svulster for omfattende flyt flowcytometri analyse av immun celle populasjoner, inkludert ex vivo analyse av T celle funksjon.
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) er en aggressiv kreft med bare 8% av pasientene overlevende 5 år1. Som mindre enn 20% av pasientene er kvalifisert for kirurgisk reseksjon2, fersk pasientprøver er ikke lett tilgjengelig for forskning og dermed in vivo -modeller gir viktige verktøy for å undersøke denne sykdommen. Det er flere murine modeller av PDAC: orthotopic, subkutan, transgene, intravenøs og pasient-avledet xenograft (PDX), beskrevet her3. Den orthotopic modellen som beskrives her, tillater injeksjon av syngeneic PDAC-celler inn i bukspyttkjertelen av immunkompetente mus. Dette kan utføres i store kohorter av ville-type eller mutant mus, og dermed gir en kostnadseffektiv og konsistent modell for sammenligning av terapeutiske midler. Viktigere, den orthotopic modellen gir beslektet mikromiljøet for tumor cellevekst og metastasizes i våre hender og andre4 til klinisk relevante nettsteder (for eksempel lever), noe som gjør det mer klinisk relevant enn subkutan eller kjemisk indusert modeller. Orthotopic svulster vise viktige funksjoner i PDAC, for eksempel en sterk desmoplastic reaksjon med en overflod av fibroblaster og ekstracellulære matrise deponering5. Transgene-modeller av PDAC er gullstandarden for murine-modellen, og den mest brukte er KPC-modellen, som uttrykker mutant KrasG12D/+ og Trp53R172H/+ under den bukspyttkjertel spesifikke PDX-1-grobunn promoter6. Ytterligere KPC og andre in vivo PDAC modeller er gjennomgått her7. KPC mus spontant utvikle bukspyttkjertel svulster med en sykdomsprogresjon som trofast replikerer funksjoner av menneskelig PDAC6. Men, som for alle transgene-modeller, er avl programmet kostbart, tumorprogresjon er variabel og derfor ofte krever store kohorter av mus. PDX-modeller bruker pasient-avledede tumorceller eller brikker som deretter dyrkes enten orthotopically eller oftere subkutant i immunsupprimerte mus. Xenograft modeller gir nyttige verktøy for screening terapeutiske forbindelser og konto for pasient heterogenitet. Men de gir ikke en komplett uimottakelig mikromiljøet, og dermed begrense sine søknader8,9.
Når etablert, orthotopic svulster vanligvis ta rundt 1 måned eller mer å vokse (avhengig av cellelinjen brukes) og danne store svulster som kan lett avbildet ved ultralyd eller MRI å spore progresjon og bestemme behandling effekt4,5,10. Men en gang i eksponentiell vekst, den siste fasen av tumor vekst kan være rask, så de fleste behandlingsregimer er påbegynt relativt tidlig (f. eks, 14 dager)11,12. Immunsystemet spiller en avgjørende rolle i tumor utvikling, blant annet i PDAC, som er preget av en immunsuppressiv svulst infiltrere med relative mangelen av T-celler og hyppig tilstedeværelse av myelogen celler13. En høy tilstedeværelse av T celler i PDAC tildeler en bedre prognose14,15. Men som enkelt agenter, immun kontrollpunkt hemmere som avlaste T celle immunsuppresjon, slik som anti-CTLA-416 og anti-PD-L117, har ikke vist klinisk nytte i PDAC pasienter, mest sannsynlig fordi den samlede T celle reaktivitet er svært lav. Men agenter som Prime T celle svar, for eksempel anti-CD40, kan overvinne anti-PD-L1/CTLA-4 motstand18,19 og vaksinasjon med GM-CSF-sekresjon allogene PDAC vaksine (GVAX) kan øke immunogenisitet av PDAC svulster20, noe som indikerer at styrking T celle svar former viktig terapeutisk Avenue.
Kritisk til en antitumoral T celle respons er erkjennelsen av tumor-avledet antigener via T-celle reseptor (TCR) og den påfølgende produksjon av cytotoksisk cytokiner og granulater. Mens T celle antigen-anerkjennelse kan bestemmes av TCR sekvensering, denne tilnærmingen er kostbart og tidkrevende. Men kvantifisering av tumor-infiltrere T-celle delsett gir en god indikasjon på en anti-tumoral respons. Videre undersøkelse av T celle aktivitet ex vivo i form av degranulering, cytokin produksjon og andre cytotoksisk faktorer gir en dypere funksjonell analyse. Disse analysene kan utføres på fersk tumor prøver og mange parametre for T-celle-funksjonen kan måles raskt ved å flyte flowcytometri.
CD8+ og CD4+ T celler produserer cytokiner slike IFNγ og TNFα å forsterke en immunrespons21. IFNɣ induserer MHCI oppregulering på målceller, induserer differensiering og rekruttering av immunceller og hjelpemidler celle død. IFNγ produksjon av CD8+ T celler er godt preget til å være en del av en antitumoral respons og samsvarer med tumor regresjon22,23. TNFα er en annen proinflammatoriske cytokin produsert av både CD8+ og CD4+ T celler. Det forbedrer TCR-avhengige aktivering og spredning av T-celler, hjelpe anti-tumoral respons. Ved TCR engasjement, cytotoksisk CD8+ T celler kan gjennomgå degranulering, der pre-formet sekretoriske lysosomer inneholder cytotoksisk molekyler slippes ut i immunologiske synapse å forårsake mål-celle degradering21. Disse molekylene inkluderer Perforin, et protein som binder seg til målet cellemembranen, danner porer som deretter forstyrrer membran integritet og tillater diffusjon21 eller endocytose24 av andre cytotoksisk molekyler, slik som Granzyme B, direkte inn i cytoplasma av målcellen. Granzyme B er en protease som enacts nedbrytningen av flere proteiner i målcellen, noe som fører til celle død21. Utgivelsen av slike molekyler krever exocytosis av endosomes til celleoverflaten, der endosomal markør CD107a (også kjent som LAMP-1) er midlertidig innlemmet i cellemembranen25.
Målingen av cytokin sekresjon av T-celler krever deres isolasjon av enten Flow-assistert celle sortering eller perle-baserte separasjon analyser, som ikke kan lett utføres på stort antall prøver samtidig. Måling av intracellulære cytokiner krever imidlertid ikke noen forhånds isolasjons trinn og kan enkelt utføres på flere prøver samtidig, noe som gir en tilnærming med høyere gjennomstrømning. Som cytokiner er raskt skilles ut av T-celler, kan intracellulære nivåer være undetectable og dermed T-cellen krever stimulering for å øke basal cytokin produksjon. For å vurdere antigen-drevet cytokin produksjon, antigen anerkjent av TCR må presenteres til T-cellen ved en primet APC in vitro. I tilfeller der antigen spesifisitet er ikke kjent, en bred stimulering tilnærming er nødvendig. TCR stimulering kan etterlignet ved hjelp av anti-CD3/28 perler som gir både TCR aktivering og costimulation, som induserer cytokin produksjon og spredning. Men et mer kostnadseffektivt alternativ er bruk av PMA og ionomycin, som sammen bredt aktivere signalering trasé som fører til syntese og frigjøring av intracellulære cytokiner. Nærmere bestemt, PMA aktiverer protein kinase C (PKC) og ionomycin hever intracellulære ca2 + ioner, fører til økt celle signalering. For å bevare intracellulære innhold av cytokiner, kan denne stimulering effektivt kombineres med protein-transport hemmere brefeldin A og monensin, som blokkerer proteiner i Golgi og dermed hindre ekstracellulære utgivelse. Bruken av PMA/ionomycin er en veletablert metode for å stimulere T-celler og det er en sterk sammenheng mellom ekstracellulære-utgitt og intracellulære cytokiner26. Stimulering av T-celler med PMA og ionomycin øker også lysosome smugling til cellemembranen og dermed CD107a blir midlertidig integrert på celleoverflaten før den resirkuleres i cellen. Ved å inkludere et anti-CD107a antistoff under stimulering, er det mulig å bruke det som en markør for degranulering aktivitet25.
Denne metoden raskt fordøyer svulster for å gi en enkelt celle suspensjon. På dette punktet, kan enkelte populasjoner være direkte farget for Flow flowcytometri eller renset ved nedstrøms metoder: Flow-assistert celle sortering eller magnetisk-perle separasjon. Utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon for flyt flowcytometri analyse gir høy gjennomstrømming analyse av flere immun celle populasjoner og deres fenotypiske markører, som gir en nøyaktig kvantifisering av immun celle nummer og fenotype.
Til slutt, fordøyelsen protokollen beskrevet her hindrer celle-overflaten markører tap og opprettholder immun celle levedyktighet, slik at immunceller til å gjennomgå ytterligere celle rensing trinn og kultur som kreves. Imidlertid har denne metoden ikke blitt testet for avledet epitelceller fra denne fordøyelsen.
In vivo -modeller av kreft i bukspyttkjertelen gir uvurderlig verktøy for å forstå sykdomsprogresjon og vurdere nye legemiddel mål3. Spesielt den orthotopic modellen er en kostnadseffektiv og reproduserbar modell som kan brukes i store kohorter av mus samtidig4,27. Den orthotopic modellen gir også beslektet mikromiljøet og intakt immunsystem for tumor vekst, noe som gjør det mer hensiktsmessig enn subkutan og PDX-modeller. Vi har imidlertid funnet at noen elementer av immun infiltrasjon kan variere mellom orthotopic modellen og KPC mus, gull-standard murine modell10. En årsak til dette kan være akselerert tumorveksten sett i orthotopic modellen. Ytterligere forskjeller i tettheten av immun celle undergrupper har blitt beskrevet mellom orthotopic og subkutan modeller3,28. Selv om transgene KPC-modellen er mer kostbar og variabel6, bør derfor nøkkel funnene verifiseres i en liten KOHORT av KPC-mus der det er mulig.
Utarbeidelse av tumorceller for orthotopic kirurgi er et kritisk trinn i protokollen. Celler bør alltid være i loggen fase av vekst og mycoplasma-og smitte-fri. Orthotopic kirurgi bør utsettes hvis det er noen bekymringer over tumor cellevekst. Bruken av kjelleren membran forbedrer tumor forekomstrate over sprøytebruk celler uten den29 og reduserer celle lekkasje og dermed bukhulen spredt27. Men når suspendert i kjelleren membran, bør tumorceller raskt injiseres (innen 2 timer) for å unngå celle tap. Antall tumorceller som kreves for å generere svulster er sannsynlig å være celle-linje avhengig, og en rekke celle tall bør testes (f. eks, fra 100-100 000) som også kan bestemme tid til å nå endepunkt. Det er sannsynlig at det vil være en feilmargin når du forbereder 1 000 celler per mus for injeksjon; Derfor, hvis flere dager med kirurgi er nødvendig, behandling av grupper bør spres likt på tvers av dager for å kontrollere for batch effekter. De fleste kirurgiske skritt kan endres avhengig av preferanser; imidlertid må det utvises forsiktighet for ikke å forstyrre kjeller membranen ved utskifting av bukspyttkjertelen i bukhulen eller lukking av bukhulen. Kjeller membran lekkasje kan forårsake tumor cellevekst på bukhulen, som dannes raskt og kan resultere i å måtte ofre dyret tidligere.
Ideelt bør kreft i bukspyttkjertelen bli raskt fordøyd etter innhøsting og forberedt for ex vivo stimulering umiddelbart. Imidlertid, denne kunne ikke være mulig hvis det er en stor bakst av svulst å innhøsting, i dette tilfellet svulst burde være holdt opp på isen og oversikten inne bakst. Type, konsentrasjon og lengde på eksponering for fordøyelsesenzymer har alle blitt vist å påvirke et stort antall overflate molekyler på immunceller30,31,32. Fordøyelsen tiden er også bevisst kort til å begrense celle død33. Fordøyd celler kan fryses ned i frysing medium for langtidslagring; imidlertid vil noen celle tap oppstå når tine. Fordøyelsen prosessen kan være mindre enn optimal hvis svulsten brikkene er ikke tilstrekkelig terninger før kollagenase inkubasjons og dette vil være tydelig så hardt tumor brikker vil forbli i filteret etter fordøyelsen. Den kollagenase konsentrasjon kan senkes hvis arbeider med sunne bukspyttkjertel eller tidlig-stadium svulster; rapporter om utvinning av sunne bukspyttkjertelen ductal celler bruker betydelig lavere konsentrasjoner34. En høy grad av epitel celle død er å forvente under fordøyelsen; Imidlertid bør immunceller tolerere prosessen godt. Alternative metoder finnes for å isolere levedyktige epitelceller for organoid vekst35 eller for å bevare vevs arkitektur36.
Endringer i stimulering protokollen kan gjøres enkelt, avhengig av ønsket lese-ut og immun celle analysert (f. eks makrofager eller B-celler). Bruken av Pan-stimulering reagenser PMA/ionomycin ikke diskriminerer ikke for TCR-antigen spesifisitet, noe som gjør det nyttig når antigen er ikke kjent. Imidlertid er produksjonen av IFNɣ nært knyttet til TCR engasjement37 og både IFNɣ og TNFα produksjon er AVGJØRENDE i PDAC antitumoral responser38. PMA/ionomycin stimulering reflekterer maksimal kapasitet på T-celler til å produsere cytokiner, som kan eller ikke kan produseres av T-cellene i tumor mikromiljøet. Endogene produksjonen kan måles uten behov for stimulering; nivåer kan imidlertid være langt lavere eller umulig å oppdage. Det finnes alternative metoder for å stimulere T-celler: anti-CD3/28-belagte perler, som også ikke krever antigen eller faktisk andre immun celle populasjoner. Fordelen med denne metoden er å tillate kvantifisering av cytokin produksjon av bestemte T celle delsett uten behov for separasjon metoder. Andre markører for cytotoksisitet (granzyme B og Perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppresjon (IL-10) kan også legges til21. Høy kvalitet Flow flowcytometri antistoffer er imidlertid ikke tilgjengelig for å oppdage alle cytokiner og faktorer av interesse. Derfor, hvis det er andre programmer som ELISA krevde stimulering kan utføres uten inkludering av brefeldin A/monensin, slik at cytokin slipper inn i supernatanten. Men, av notatet, vil dette tillate total celle cytokin utgivelse og det vil ikke være mulig å bestemme hvilke celle populasjoner bidratt.
IFNγ produksjon er en dominerende funksjon i en antitumoral T celle respons, ofte brukt som en erstatning for TCR-antigen Recognition37,38. Andre in vivo -metoder som mer presist definerer antigen-spesifikke tiltak utnytte tumorceller uttrykker et kjent antigen, som OVALBUMIN eller SV40. Universal antigen kan deretter brukes ex vivo å teste T celle gjenkjennelse eller i kombinasjon med en TCR-begrenset vert mus. Alternativt, der antigen er ukjent, kvantifisering av T Cell klonal ekspansjon kan utføres av bulk-TCR sekvensering, eller mer nylig enkelt celle TCR sekvensering39,40. For å fullt ut forstå tilstanden til intratumoral T celle respons, markører indikasjon av utmattelse eller hemmende reseptorer bør også måles inkludert: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. I tillegg til markører for effektor T-celler (CD44 Hi, CD62lo) og proliferativ aktivitet, Ki67+ eller CSFE fortynning41,42,43,44. Samlet sett gir den orthotopic modellen en nyttig plattform for å raskt teste terapeutiske strategier, spesielt som kan modulere antitumoral T-celle respons, som deretter kan valideres på en mindre kohort av transgene, KPC, mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Animal Technician service og Dr. Alzbeta Talarovicova (Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for deres assistanse under orthotopic kirurgi. Vi vil også gjerne takke Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannia) for hennes veiledning i kirurgisk teknikk, Dr. Cristina Ghirelli (-Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for hennes råd om tumor fordøyelsen og Dr. Fabienne McClanahan (Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for hennes råd om ex vivo T celle stimulering protokoller. Vi ønsker også å takke Medical Research Council (MRC), bukspyttkjertelen Cancer Research Fund (PCFR) og eggstokkene Cancer action som finansierte denne forskningen.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |