生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する
Summary
我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。
Abstract
マウスモデルは、インビボ癌研究のベンチマーク検査です。しかし、コスト、時間、倫理的配慮により、生体内がんモデルの代替が求められています。鶏絨毛性膜(CAM)モデルは腫瘍の発生の直接視覚化を可能にし、生体内のイメージ投射のために適している安価で、急速な代わりの代わりを提供する。そこで、婦人科腫瘍と泌尿器科腫瘍をこのモデルに移植するための最適化されたプロトコルを開発しようとしました。受精後約7日間、空気細胞は卵の血管化側に移動し、そこで開口部がシェルに作成される。マウスおよびヒト細胞株および一次組織からの腫瘍は、その後生着することができる。これらは、通常、細胞外マトリックスと培地の混合物に播種され、細胞の分散を回避し、細胞が血管供給を募集するまで栄養補助を提供する。腫瘍は、卵が孵化する前にさらに14日間まで成長し得る。ホタルルシフェラーゼを安定してトランスキュアした細胞を移植することにより、生物発光イメージングは、胚全体に広がる膜および癌細胞上の腫瘍増殖の敏感な検出に使用することができる。このモデルは、潜在的に腫瘍原性、浸潤、転移、および治療効果を研究するために使用することができます。鶏のCAMモデルは従来のマウスモデルと比較してかなり少ない時間および財源を必要とする。卵は免疫不全で免疫寛容であるため、あらゆる生物の組織を、ヒト組織の移植に必要な高価なトランスジェニック動物(例えばマウス)なしで移植できる可能性がある。しかし、このモデルの利点の多くは、腫瘍発生時間の短縮や免疫不全/免疫寛容な状態など、潜在的に制限である可能性があります。さらに、ここに提示されたすべての腫瘍タイプは鶏絨毛性膜モデルに生着したが、腫瘍の成長の程度はさまざまである。
Introduction
マウスは、悪性腫瘍を含むヒト疾患の研究のための古典的なモデル生物として機能している。哺乳類として、彼らは人間と多くの類似点を共有しています。それらの高度な遺伝的類似性は、ヒト疾患の遺伝的制御に対する巨大な洞察を提供するために、マウスゲノムのトランスジェニック操作を可能にした1.マウスの取り扱いと実験に関する豊富な経験は、その結果、生物医学研究のための選択のモデルとなっています。しかし、マウスモデルに関する倫理的および科学的な懸念に加えて、彼らはまた、非常に高価で時間がかかる可能性があります2,3.腫瘍の発症には数週間から数ヶ月かかる場合があります。典型的な施設の住宅だけでも、腫瘍が発達している間、数百〜数千ドルで実行することができます。卵巣癌は、マウスモデルの成長が容易に数ヶ月かかることがあるため、この欠点の一例である。研究の進行の遅れは、卵巣癌患者の持続的に低い5年生存率にわずか47%(すなわち、30年間でわずか10%の生存率の増加)に影響を与える可能性4。同様に、泌尿器科癌(腎臓、前立腺、膀胱癌)は、米国における全癌症例の19%、癌関連死の11%を占めている4。したがって、婦人科癌と泌尿器科癌を研究するための新しいインビボアプローチは、たとえこのモデルが最初のスクリーニング実験にのみ適用されるとしても、実験室にかなりの時間、労力、そしてお金を節約できる。さらに、結果として得られる研究結果の加速は、これらの癌と診断された177,000人の個人に大きな影響を与える可能性があります。
Chicken CAMモデルは、前述の問題に対処する多くの利点を提供します。血管新生5、6、腫瘍細胞浸潤7、8、転移7、9を研究する一般的なモデルは、神経膠腫10、11、12、頭頸部および頸部扁平上皮癌13、14、白血病15、16、膵臓癌17、膵臓癌17、および膵臓癌17、および癌の多くの形態を研究するために既に使用されている大腸癌18.さらに、CAMモデルは、神経芽細胞腫19、バーキットリンパ腫20、黒色腫21、およびネコ線維肉腫22に対して生成されている。以前の研究では、膀胱癌23および前立腺癌細胞株24の生着も提示されているが、プロトコルの詳細は限られている。卵はマウスよりずっと安いだけでなく、再現性の高い結果25、26を生み出す。それらは速い血管系の発達を示し、腫瘍の生着は数日の速さで起こり、開いた窓を通して縦方向に視覚化することができる。卵子受精と孵化の間の21日の時間枠で、実験は数週間以内に完了することができます。さらに、低コスト、限られた住宅ニーズ、および小型は、マウス研究のために禁止される大規模な実験を容易に可能にする。
そこで、婦人科がんや泌尿器科がんの生着に向けてCAMモデルを最適化することを検討しました。初期の鶏胚27の免疫不全状態のために、マウスおよびヒト細胞の両方を容易に移植することができる。したがって、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌の生着に成功しました。これらの腫瘍タイプのそれぞれについて、CAMは確立されたマウスおよび/またはヒト腫瘍細胞株を容易に受け入れる。重要なことに、採取された新しい原発性ヒト腫瘍組織は、消化された細胞または高い成功率を有する固形組織の断片から生着することもできる。これらのがんの種類と細胞源のそれぞれは、最適化が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
CAMモデルを用いた腫瘍の拡大および生着は既存のin vivo動物モデルよりより速く、直接観察可能な腫瘍の成長を可能にする。さらに、特に免疫不全マウスのコストと比較して、機器の最初の購入が完了すると、コストは大幅に低くなります。鶏の胚の初期の免疫不全状態は、ヒトおよびマウス組織の生着を容易に可能にする。これらの強みがあっても、CAM モデルには制限があります。長期的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この方法に関する最初の訓練に対して、玉野井冬彦博士とビン・ヴー博士に感謝したいと考えています。エヴァ・コジオレク博士との議論は、このアプローチの最適化に役立ち、非常に高く評価されています。この研究は、以下の情報源からの資金提供なしには不可能でした:タバコ関連疾患研究プログラム博士研究員(27FT-0023、 ACS、国防総省(DoD)卵巣癌研究プログラム(W81XWH-17-1-0160)、NCI/NIH(1R21CA216770)、タバコ関連疾患研究プログラムハイインパクトパイロット賞(27IR-0016)、UCLA機関支援、 JCCCシードグラント(NCI /NIH P30CA016042)とLW研究担当副首相室からの3R助成金を含む。
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
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