Brug af kylling chorioallantoic membran i Vivo Model til at studere gynækologiske og urologiske kræftformer

Summary

Vi præsenterer kylling chorioallantoic membran model som en alternativ, transplanterbar, in vivo model for engraftment af gynækologiske og urologiske kræft cellelinjer og patient-afledte tumorer.

Abstract

Musemodeller er benchmarktest for in vivo kræft undersøgelser. Men, omkostninger, tid og etiske overvejelser har ført til opfordringer til alternative in vivo kræftmodeller. Kylling chorioallantoic membran (CAM) model giver en billig, hurtig alternativ, der tillader direkte visualisering af tumor udvikling og er velegnet til in vivo imaging. Som sådan forsøgte vi at udvikle en optimeret protokol til ompodning gynækologiske og urologiske tumorer i denne model, som vi præsenterer her. Ca. 7 dage efterbefrugtning, luftcellen flyttes til den vaskulære side af ægget, hvor en åbning er skabt i skallen. Tumorer fra murine og menneskelige cellelinjer og primære væv kan derefter indpodet. Disse er typisk seedet i en blanding af ekstracellulære matrix og medium for at undgå cellulære spredning og give næringsstof støtte, indtil cellerne rekruttere en vaskulær forsyning. Tumorer kan derefter vokse i op til yderligere 14 dage før æggene ruge. Ved at implantere celler stabilt transduceret med firefly luciferase, bioluminescens imaging kan bruges til følsom påvisning af tumorvækst på membranen og kræftcelle spredes i hele fosteret. Denne model kan potentielt bruges til at studere tumorigenicity, invasion, metastase, og terapeutisk effektivitet. Kylling CAM model kræver betydeligt mindre tid og finansielle ressourcer i forhold til traditionelle murine modeller. Da æggene er immunkompromitterede og immuntolerante, kan væv fra enhver organisme potentielt implanteres uden dyre transgene dyr (f.eks. mus), der kræves til implantation af humane væv. Men, mange af fordelene ved denne model kunne potentielt også være begrænsninger, herunder den korte tumor generation tid og immunkompromitteret / immuntolerant status. Derudover, selv om alle tumor typer præsenteres her engraft i kylling chorioallantoic membran model, de gør det med varierende grader af tumor vækst.

Introduction

Mus har tjent som den klassiske model organisme for studiet af sygdomme hos mennesker, herunder malignitet. Som pattedyr deler de mange ligheder med mennesker. Deres høje grad af genetisk lighed har gjort det muligt for transgen manipulation af musegenomet at give enorm indsigt i den genetiske kontrol af sygdomme^{hos mennesker 1.} Omfattende erfaring i håndtering af og eksperimenter med mus har resulteret i, at de er den foretrukne model for biomedicinsk forskning. Men ud over de etiske og videnskabelige bekymringer vedrørende murine modeller, kan de også være ganske dyrt og tidskrævende^2,3. Udviklingen af tumorer kan tage uger eller endda måneder. Boligerne på en typisk institution alene kan køre i hundreder til tusindvis af dollars, mens tumorer er ved at udvikle. Kræft i æggestokkene er et eksempel på denne ulempe, fordi dens vækst i murine modeller let kan tage måneder. Forsinkelser i forskningsfremskridt påvirker potentielt kræftpatienter i æggestokkenes vedvarende lave 5-årige overlevelsesrate på kun 47 % (dvs. en stigning i overlevelsen på kun 10 % over 30 år)⁴. Tilsvarende, urologiske kræftformer (nyre-, prostata- og blærekræft) udgør 19% af alle kræfttilfælde i USA og 11% af kræftrelaterede dødsfald⁴. Således kan en ny in vivo tilgang til at studere gynækologiske og urologiske kræftformer spare et laboratorium lang tid, arbejdskraft og penge, selv om denne model kun anvendes til indledende screening eksperimenter. Derudover, den resulterende acceleration af forskningsresultater kan påvirke de 177.000 personer diagnosticeret med disse kræftformer årligt.

Kylling CAM model tilbyder mange fordele, der løser de førnævnte spørgsmål. En populær model til at studere angiogenese^5,6,tumorcelle invasion^7,8,og metastase^7,9, chick embryo CAM model er allerede blevet brugt til at studere mange former for kræft, herunder gliom^10,11,12, hoved og hals planocellulært karcinom^13,14, leukæmi^15,16, kræft i bugspytkirtlen¹⁷, og kolorektal cancer¹⁸. Derudover, CAM modeller er blevet genereret for neuroblastoma¹⁹, Burkitt lymfom²⁰, melanom^21,og feline fibrosarkom²². Tidligere undersøgelser har også præsenteret engraftment af blærekræft²³ og prostatakræft cellelinjer²⁴, men med begrænset protokol detaljer. Ikke alene er æg meget billigere end mus, men de producerer også meget reproducerbare resultater^25,26. De viser hurtig vaskulatur udvikling, og tumor engraftment kan forekomme i så hurtigt som et par dage og visualiseres langsgående gennem det åbne vindue. Med 21 dages tidsramme mellem ægbefrugtning og udklækning, kan eksperimenter være afsluttet inden for et par uger. Desuden tillader de lave omkostninger, begrænsede boligbehov og små størrelselet eksperimenter, der ville være uoverkommelige for musestudier.

Derfor forsøgte vi at optimere CAM-modellen til engraftment af gynækologiske og urologiske kræftformer. På grund af den immunkompromitterede status af den tidlige kylling embryo²⁷, både mus og menneskelige celler kan implanteres let. Som sådan har vi med succes podet æggestokkene, nyre, prostata, og blærekræft. For hver af disse tumortyper accepterer CAM let etablerede murine og/eller humane tumorcellelinjer. Vigtigere, friskhøstet primære menneskelige tumorvæv kan også engraft fra enten fordøjet celler eller stykker af fast væv med høje succesrater. Hver af disse kræfttyper og cellekilder kræver optimering, som vi deler her.

Protocol

Alle de eksperimenter, der præsenteres heri, blev gennemgået og godkendt af de relevante etiske udvalg ved University of California, Los Angeles (UCLA). Brugen af identificerede, primære menneskelige tumorer er blevet godkendt af UCLA Institutional Review Board (Protokol numre 17-000037, 17-001169, og 11-001363). På UCLA er animal research committee gennemgang ikke påkrævet for forsøg med kylling embryoner; protokolgodkendelse er kun påkrævet, når æggene udklækkes. Men bedste praksis, såsom AVMA’s retningsli…

Representative Results

Hidtil har vi fundet denne metode til implantation at være en succes for æggestokkene, nyre, prostata, og blærekræft. Hver blev optimeret til at identificere specifikke betingelser for implantation, selv om der kan være fleksibilitet. Af de testede tumortyper var væksten i æggestokkene langt mindre udtalt og typisk ikke synlig uden hjælp fra bioluminescensbilleddannelse (figur 1). Men en afstivning af CAM kunne mærkes med pincet i området for implan…

Discussion

Tumor ekspansion og engraftment ved hjælp af CAM model tillader hurtigere og direkte observerbare tumor vækst end eksisterende in vivo dyremodeller. Desuden er omkostningerne betydeligt lavere, når det oprindelige køb af udstyr er afsluttet, især sammenlignet med omkostningerne ved immunkompromitterede mus. Den oprindelige, immunkompromitterede tilstand af kylling embryoner let tillader engraftment af humane og murine væv. Selv med disse styrker har CAM-modellen begrænsninger. Den korte tid, der kan være en forde…

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.