Method Article

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

DOI:

10.3791/60653

⸱

March 25th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

Abstract

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상처 치유는 염증, 과립 조직 형성, 섬유증 및 분해의 질서 정연한 진행을 필요로하는 복잡한 과정입니다. Murine 모델은 이러한 프로세스에 대한 귀중한 기계적 통찰력을 제공합니다. 그러나 상처 치유 반응의 모든 측면을 완전히 해결하는 단일 모델은 없습니다. 대신 여러 모델을 사용하여 상처 치유의 다양한 측면을 해결하는 것이 이상적입니다. 여기서, 상처 치유 반응의 다양한 양상을 해결하는 두 가지 다른 방법이 설명된다. 첫 번째 모델에서, 폴리 비닐 알코올 스폰지는 피하 마우스 dorsum을 따라 이식된다. 스폰지 검색 다음, 세포는 기계적 중단에 의해 분리 될 수 있으며, 유체는 원심 분리에 의해 추출 될 수있다, 따라서 급성 상처 환경에서 세포 및 사이토 카인 반응의 상세한 특성을 허용. 이 모델의 한계는 상처 폐쇄 속도를 평가할 수 없다는 것입니다. 이를 위해 꼬리 피부 절제 모델이 활용됩니다. 이 모델에서는 꼬리 의 기저부 근처의 등쪽 표면을 따라 10mm x 3mm 직사각형 의 꼬리 스킨 조각을 절제합니다. 이 모델은 치부 분석을 위해 쉽게 촬영하여 치유 속도를 결정할 수 있으며 조직학적 분석을 위해 절제될 수 있습니다. 설명된 두 방법 모두 유리하게 변경된 마우스 긴장에서 이용될 수 있습니다, 또는 상처 치유 기계장치를 해명하기 위하여 당뇨병, 노화, 또는 이차 감염과 같은 comorbid 조건의 모형과 함께.

Introduction

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상처 치유 과정을 검사할 수 있는 많은 뮤린 모델 시스템이 있으며, 각각 특정 한 장점과 한계를 가지고1,,2. 다음 방법은 두 개의 뮤린 상처 모델을 제시하며, 각 모델은 상처 치유 반응의 특정 측면을 다루고 부상에 대한 반응에서 교란의 원인과 효과를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 상처 치유 과정은 별개의 단계에서 발생합니다. 첫 번째 단계는 혈소판, 호중구 및 단핵구 / 대식세포의 급속한 유입뿐만 아니라 전염증성 사이토 카인 및 케모카인의 생산을 특징으로하는 염증성입니다. 염증의 해결에 따라, 환경은 profibrotic 및 proangiogenic 사이토 카인 및 성장 인자의 유도와 함께 더 회복 상태로 전환. 과립 조직은 증착되고 신혈관은 근섬유 아세포, 섬유 아세포, 상피 세포 및 내피 세포의 이동과 함께 형성됩니다. 최종 단계에서 임시 세포 외 매트릭스가 리모델링되고 흉터 형성 및 상처 폐쇄가2,3,34,45,5,

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Protocol

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여기에 설명된 모든 동물 연구는 브라운 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원의 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었습니다.  참고: 비디오에서는 데모 목적으로 수술용 드레이프가 생략되었습니다.

1. PVA 스폰지의 피하 이식

  1. 가위를 사용하여 PVA 스폰지 시트를 8mm x 8mm x 4mm 조각으로 자릅니다. 비커에 멸균 1x PBS에 담가 PVA 스폰지 조각을 다시 수화.
  2. 스폰지를 1x PBS로 오토클레이브하여 살균하고 완전히 식힙니다. 4 °C에서 멸균 1x PBS에 오토 클레이브 스폰지를 저장합니다.
  3. 외과 적 이식을 수행하기 전에, 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 멸균 배양 접시에 스폰지의 필요한 수를 aliquot. 여분의 스폰지를 멸균 1x PBS에 보관하여 향후 사용을 위해 4°C에 보관하십시오. 재수화 후 스폰지가 1cm x 1cm x 0.5cm로 팽창하도록 하십시오. 탈수 된 PVA 스폰지의 이미지는 그림 1A에표시됩니다.
    참고 : 수술 부위의 멸균성을 유지하기 위해 PVA 스폰지 이식 절차는 한 개인이 마우스를 처리하고 수술 부위를 준비하고 두 번째 사람이 이식을 수행해야합....

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Results

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PVA 스폰지 이식 다음 전신 염증 반응
PVA 스폰지 이식 수술은 상처 후 1일 동안 플라즈마에서 IL-6의 유도에 의해 입증된 바와 같이 전신 염증 반응을일으켰다(도 2A). TNF-α 및 IL-1β를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인뿐만 아니라 CCL2 및 CXCL1을 포함하는 케모카인의 배열은 PVA 후 7일 동안 전세포증으로 유도되었고, 다른 곳에서26,,30을기재하였다.

PVA 스폰지 상처에서 세포와 액체의 격리
PVA 스폰지 상처 모델의 주요 장점은 급성 세포 상처 치유 반응의 현상형 및 기능 분석을위한 충분한 세포를 복구 할 수있는 능력이다. PVA 스폰지 상처로부터 회복 될 수있는 세포의 수는 상처 당일 1 x 10 6 에서 8 x 10.......

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Discussion

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이 문서는 급성 상처 치유 반응의 평가를 허용 하는 두 가지 견인 뮤린 상처 모델을 설명 합니다. 첫 번째 방법은 등지 피하 공간에서 PVA 스폰지의 외과 이식을 포함한다. 이 접근법은 고립된 스폰지로부터 수득된 많은 수의 세포 및 상처 체액의 양으로 인해 세포 상처 치유 반응을 연구하기 위한 생검 기반 상처 모델보다 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 절차의 성공적인 실행을 위해, 절개 주위 피부를 철저히 청소하여 멸균 수술 장을 유지하는 것은 필수적입니다, 상처에 박테리아의 전좌는 크게 치유의 과정을 변경합니다. 여기에 기술된 세포 분리 방법을 사용하여, 스폰지 추출 의 시간에 따라 PVA 스폰지로부터 적어도 1-10 x 106 세포를 분리할 수 있다. PVA 스폰지 상처로부터 분리된 세포의 대부분은 실행가능하다(그림 2D). 그러나, 죽은 세포가 기계적 중단 후에 단리된 상처 세포의 ~20%까지 구성할 수 있기 때문에, 유세포 분석 기지를 둔 분석을 진행할 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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저자는 브라운 대학 유동 세포 분석 및 선별 시설의 케빈 칼슨 (Kevin Carlson)에게 유동 세포 분석 실험에 대한 상담 및 지원에 감사드립니다. 그림 1B 및 C의 이미지는 BioRender로 작성되었습니다. 카일 리와 그레고리 세르파는 사진 촬영에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) YFAA15 D15AP0100, 신흥 새로운 과학 상 (브라운 대학), 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, 국립 환경 과학 연구소 (NIES) T32-ES7272 (환경 병리학 교육), 브라운 대학 연구 종자 상.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x 인산염 완충 식염Fisher ScientificBP3991
15 mL 원심분리 튜브, OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+칼슘, +마그네슘, – 페놀 레드)ThermoFisher Scientific14025076
5ml 주사기BD309646
안티 마우스 CD45.2-APC Fire750BioLegend109852Clone 104
안티 마우스 F4/80-eFluor660ThermoFisher Scientific50-4801-82클론 BM8
안티 마우스 Ly6C-FITCBD Biosciences553104클론 AL-21
안티 마우스 Ly6G-PerCP-eFluor710ThermoFisher Scientific46-9668-82클론 1A8-Ly6g
안티 마우스 Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183클론 E50-2440
Autoclip 스테인레스 스틸 상처 클립 애플리어Braintree ScientificNC9021392
Autoclip 스테인레스 스틸 상처 클립, 9mmBraintree ScientificNC9334081
블렌더 백, 80mLFisher Scientific14258201
배양 튜브, 16mL, 17x100Genesee Scientific21-130
소 태아 혈청 - 표준ThermoFisher Scientific10437028
고정성 생존도 염료 eFluor506ThermoFisher Scientific65-0866-14
헤페스 용액, 1MGenesee Scientific25-534
ImageJ SoftwareNIH
페니실린-스트렙토마이신(5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
폴리비닐 알코올 스폰지 - 큰 기공 크기Ivalon/PVA 무제한
www.sponge-pva.com 포비돈-요오드 용액, 10%Fisher Scientific3955-16
스프레이 배리어 필름, Cavilon3M3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V수어드0080/000/AJ
수

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T.....

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Wound Healing ModelsPVA Sponge ImplantationTail Skin ExcisionCellular IsolationFluid ExtractionPlanimetric AnalysisHistological AnalysisCytokine KineticsWound Closure AssessmentInflammatory Response

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