Her præsenterer vi en protokol til påvisning af total cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA). Denne metode kan visualisere cellulær ROS lokalisering i klæbende celler med en fluorescens mikroskop og kvantificere ROS intensitet med en fluorescens plade læser. Denne protokol er enkel, effektiv og omkostningseffektiv.
Oxidativt stress er en vigtig begivenhed under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne undersøgelse demonstrerer vi, hvordan man kvantificerer oxidativt stress ved at måle den samlede reaktive iltart (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farvning i kolorektal cancer cellelinjer som et eksempel. Denne protokol beskriver detaljerede trin, herunder forberedelse af DCFH-DA-opløsning, inkubation af celler med DCFH-DA-opløsning og måling af normaliseret intensitet. DCFH-DA farvning er en enkel og omkostningseffektiv måde at opdage ROS i celler. Det kan bruges til at måle ROS generation efter kemisk behandling eller genetiske modifikationer. Derfor er det nyttigt til bestemmelse af cellulære oxidativstress på miljøstress, der giver spor til mekanistiske undersøgelser.
Tre store reaktive ilt arter (ROS) produceret af cellulære stofskifte, der er af fysiologisk betydning er superoxid anion, hydroxyl radikal, og hydrogenperoxid1. Ved lave koncentrationer deltager de i fysiologiske celleprocesser, men ved høje koncentrationer har de negative virkninger på cellesignalveje1. Vores krop har udviklet antioxidantsystemer, som er effektive mod overdreven ROS. Men, oxidativ stress kan forekomme, når ROS overvælde afgiftende evne i vores krop, som bidrager til mange patologiske tilstande, herunder betændelse, kræft, og neurodegenerative sygdom2,3,4. Formålet med denne metode er at bestemme total cellulær ROS i klæbende celler ved hjælp af 2′,7′-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvning. Begrundelsen er, at oxidation af DCFH-DA til 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) er blevet anvendt i udstrakt grad til total ROS-detektion, herunder hydroxylradikals (•OH) og nitrogendioxid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er taget op af celler, hvor cellulære esterase kløver off acetyl grupper, hvilket resulterer i DCFH. Oxidation af DCFH ved ROS konverterer molekylet til DCF, som udsender grøn fluorescens ved en excitation bølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning af fluorescens med flowcytometri og andre alternative metoder5er fordelene ved denne metode ved hjælp af et fluorescensmikroskop og en pladelæser, at den producerer klart synlige fluorescerende billeder og er let at udføre, effektiv og omkostningseffektiv. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at opdage cellulære ROS for at studere forskellige betingelser6,7,8. Denne protokol bruges til at registrere total ROS i klæbende celler. Brug af denne metode til at opdage ROS i suspension celler kan have brug for nogle ændringer.
Den eksperimentelle protokol, der er beskrevet her, er let reproducerbar at måle cellulære samlede ROS. De kritiske trin omfatter at gøre DCFH-DA-løsningen frisk og undgå lyseksponering, minimere forstyrrelser i cellestatus og omfattende PBS-vask lige før du tager billeder. Til fremstilling af DCFH-DA arbejdsløsning skal stamopløsningen tilsættes til forvarmet DMEM lige før tilsætning i 24 brøndpladen. Årsagen er, at gamle løsninger, der genererer høj baggrund fluorescens eller lyseksponering vil føre til…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (K01DK114390), et forskningsforskerlegattilskud fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et pilotprojekt Tilskud fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og et forskningsprogram Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kræft center (P30CA118100) , og en ny investigator pris fra Dedicated Health Research Fonde ved University of New Mexico School of Medicine.
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |