2',7'-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफोरेसिन डायसेटेट स्टेनिंग द्वारा अनुयायी कोशिकाओं में कुल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाना
Summary
यहां, हम 2′, 7′-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफ्फ्लूरोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करके कुल सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ अनुयायी कोशिकाओं में सेलुलर आरओएस स्थानीयकरण की कल्पना कर सकती है और फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर के साथ आरओएस तीव्रता की मात्रा निर्धारित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल सरल, कुशल और लागत प्रभावी है।
Abstract
ऑक्सीडेटिव तनाव शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत एक महत्वपूर्ण घटना है। इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि 2′, 7′-डाइक्लोरोइडिड्रोफ्फोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएएच-डीए) का उपयोग करके कुल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को मापने के द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव को कैसे निर्धारित किया जाए। यह प्रोटोकॉल DCFH-DA समाधान की तैयारी, डीसीएफएच-डीए समाधान के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन और सामान्यीकृत तीव्रता के माप सहित विस्तृत चरणों का वर्णन करता है। डीसीएफएच-डीए धुंधला कोशिकाओं में आरओएस का पता लगाने का एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है। इसका उपयोग रासायनिक उपचार या आनुवंशिक संशोधनों के बाद आरओएस पीढ़ी को मापने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, यह पर्यावरण तनाव पर सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव का निर्धारण करने, मशीनी अध्ययनों के लिए सुराग प्रदान करने के लिए उपयोगी है।
Introduction
सेलुलर मेटाबोलिज्म द्वारा उत्पादित तीन प्रमुख प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) जो शारीरिक अर्थ के हैं, सुपरऑक्साइड एनियन, हाइड्रोक्सिल रेडिकल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड1हैं। कम सांद्रता पर, वे शारीरिक कोशिका प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, लेकिन उच्च सांद्रता पर उनका सेल सिग्नलिंग पाथवे पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है1। हमारे शरीर में एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम विकसित किया गया है, जो अत्यधिक आरओएस के खिलाफ प्रभावी हैं। हालांकि, ऑक्सीडेटिव तनाव तब हो सकता है जब आरओएस हमारे शरीर की विषहरण क्षमता को अभिभूत करता है, जो सूजन, कैंसर और,न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग2,3,,4सहित कई रोग स्थितियों में योगदान देता है। इस विधि का उद्देश्य 2′, 7′-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफ्लोफोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफए-डीए) धुंधला का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं में कुल सेलुलर आरओएस निर्धारित करना है। तर्क यह है कि डीसीएफएच-डीए से 2′-7’डाइक्लोरोफ्लोरोरेसेइन (डीसीएफ) के ऑक्सीकरण का उपयोग हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स (• ओह) और नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (• नंबर2)सहित कुल आरओएस डिटेक्शन के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। मशीनी रूप से, डीसीएफएच-डीए कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है जहां सेलुलर एस्टरेस एसिटिल समूहों से दूर होता है, जिसके परिणामस्वरूप डीसीएफएच होता है। आरओएम द्वारा डीसीएफएच का ऑक्सीकरण अणु को डीसीएफ में परिवर्तित करता है, जो 485 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 530 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर हरे रंग की फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करता है। प्रवाह साइटोमेट्री और अन्य वैकल्पिक विधियों के साथ फ्लोरेसेंस का पता लगाने की तुलना में5,फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और प्लेट रीडर का उपयोग करके इस विधि के फायदे यह हैं कि यह स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली फ्लोरोसेंट छवियों का उत्पादन करता है, और प्रदर्शन करना आसान है, कुशल और लागत प्रभावी। इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग सेलुलर आरओएस का विभिन्न स्थितियों का अध्ययन करने के लिए किया गया है6,7,8. इस प्रोटोकॉल का उपयोग अनुयायी कोशिकाओं में कुल आरओएस का पता लगाने के लिए किया जाता है। निलंबन कोशिकाओं में ROS का पता लगाने के लिए इस विधि का उपयोग कुछ संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल सेलुलर कुल ROS को मापने के लिए आसानी से प्रजनन योग्य है। महत्वपूर्ण कदमों में DCFH-DA समाधान को ताजा बनाना और प्रकाश जोखिम से बचना, सेल स्थिति अशांति को कम करना और छवियों को ले…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (K01DK1114390), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (आरएसजी-18-050-01-एनईसी), एक अनुसंधान पायलट परियोजना अनुदान से एक अनुसंधान विद्वान अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था न्यू मेक्सिको पर्यावरण स्वास्थ्य हस्ताक्षर कार्यक्रम और Superfund विश्वविद्यालय (P42 ES025589), एक साझा संसाधन पायलट परियोजना पुरस्कार और यूएनएम व्यापक कैंसर केंद्र (P30CA118100) से एक अनुसंधान कार्यक्रम समर्थन पायलट परियोजना पुरस्कार से , और न्यू मेक्सिको स्कूल ऑफ मेडिसिन के विश्वविद्यालय में समर्पित स्वास्थ्य अनुसंधान कोष से एक नया अन्वेषक पुरस्कार ।
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
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