Detektion av total reaktiva syrearter i vidhäftande celler med 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Färgning

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka totala cellulära reaktiva syrearter (ROS) med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denna metod kan visualisera cellulära ROS lokalisering i vidhäftande celler med en fluorescens mikroskop och kvantifiera ROS intensitet med en fluorescens platta läsare. Detta protokoll är enkelt, effektivt och kostnadseffektivt.

Abstract

Oxidativ stress är en viktig händelse under både fysiologiska och patologiska förhållanden. I denna studie visar vi hur man kvantifierar oxidativ stress genom att mäta totala reaktiva syrearter (ROS) med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning i kolorektal cancer cellinjer som ett exempel. Detta protokoll beskriver detaljerade steg inklusive beredning av DCFH-DA lösning, inkubation av celler med DCFH-DA lösning och mätning av normaliserad intensitet. DCFH-DA färgning är ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att upptäcka ROS i celler. Det kan användas för att mäta ROS-generering efter kemisk behandling eller genetiska modifieringar. Därför är det användbart för att bestämma cellulär oxidativ stress på miljöstr stress, vilket ger ledtrådar till mekanistiska studier.

Introduction

Tre stora reaktiva syrearter (ROS) som produceras av cellulär metabolism som är av fysiologisk betydelse är superoxid anjon, hydroxylradikal, och väteperoxid¹. Vid låga koncentrationer deltar de i fysiologiska cellprocesser, men vid höga koncentrationer har de negativa effekter på cellsignaleringsvägarna¹. Vår kropp har utvecklat antioxidant system, som är effektiva mot överdriven ROS. Emellertid, oxidativ stress kan uppstå när ROS överväldiga avgiftande förmåga vår kropp, vilket bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive inflammation, cancer, och neurodegenerativa sjukdomar^2,3,4. Syftet med denna metod är att bestämma totala cellulära ROS i vidhäftande celler med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning. Motiveringen är att oxidation av DCFH-DA till 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) har använts i stor utsträckning för total ROS-detektion inklusive hydroxylradikaler (•OH) och kvävedioxid (•NO₂). Mekanistiskt tas DCFH-DA upp av celler där cellesteras klyver av acetylgrupperna, vilket resulterar i DCFH. Oxidation av DCFH av ROS omvandlar molekylen till DCF, som avger grön fluorescens vid en excitationvåglängd på 485 nm och en utsläppsvåglängd på 530 nm. Jämfört med detektion av fluorescens med flödescytometri och andra alternativa metoder⁵är fördelarna med denna metod med hjälp av ett fluorescensmikroskop och en plattläsare att den producerar väl synliga fluorescerande bilder och är lätt att utföra, effektiva och kostnadseffektiva. Denna metod har använts i stor utsträckning för att upptäcka cellulära ROS för att studera olika villkor^6,7,8. Detta protokoll används för att upptäcka total AVKASTNING i vidhäftande celler. Använda denna metod för att upptäcka ROS i suspensionsceller kan behöva vissa ändringar.

Protocol

1. Cellsåd Frö 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller per brunn i en 24-brunnsplatta och underhåll cellerna i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) över natten vid 37 °C. Byt ut odlingsmediet mot eller utan 100 μM järnsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX) som innehåller medium och inkubat i 24 timmar. 2. Förberedelse av DCFH-DA-lösningen Lös 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfat (DMSO) för att göra en 10 mM-stamlösning. …

Representative Results

HCT116 kolorektal cancerceller behandlades med 100 μM FS eller 10 μM DOX för att inducera oxidativ stress7. Som framgår av figur 1ökade grön fluorescens dramatiskt av både FS och DOX som förväntat. För att kvantifiera den relativa intensitetsförändringen var cellerna lysed efter att ha tagit bilder och normaliserades med proteinkoncentrationer. Den kvantifierade fluorescensintensiteten ökade signifikant med FS eller DOX i HCT116-celler. <p class="jove…

Discussion

Det experimentella protokoll som beskrivs här är lätt reproducerbara att mäta cellulära totala ROS. De kritiska stegen är att göra DCFH-DA lösning fräsch och undvika ljusexponering, minimera cellstatusstörningar och omfattande PBS-tvättning precis innan du tar bilder. För beredning av DCFH-DA arbetslösning bör stamlösningen läggas till förvärmd DMEM precis innan den läggs till i 24-brunnsplattan. Anledningen är att gamla lösningar som genererar hög bakgrund fluorescens eller ljusexponering kommer at…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader