Et nyt værktøjssæt til evaluering af genfunktioner ved hjælp af betinget Cas9-stabilisering
Summary
Her beskriver vi et genomredigeringsværktøj baseret på den tidsmæssige og betingede stabilisering af grupperet regelmæssigt interspaced kort palindromisk repeat- (CRISPR-) associeret protein 9 (Cas9) under det lille molekyle, Shield-1. Metoden kan bruges til dyrkede celler og dyremodeller.
Abstract
Den regelmæssigt sammenkoblede kort palindromiske repeat- (CRISPR-) tilknyttede protein 9 -teknologi (CRISPR/Cas9) er blevet et udbredt laboratorieværktøj til at indføre nøjagtige og målrettede modifikationer i genomet. Dens enorme popularitet og hurtige spredning tilskrives dens nemme brug og nøjagtighed sammenlignet med sine forgængere. Men den konstituerende aktivering af systemet har begrænsede anvendelser. I dette papir beskriver vi en ny metode, der giver tidsmæssig kontrol af CRISPR/Cas9-aktivitet baseret på betinget stabilisering af Cas9-proteinet. Fusing en manipuleret mutant af rapamycin-bindende protein FKBP12 til Cas9 (DD-Cas9) gør det muligt hurtigt nedbrydning af Cas9, som igen kan stabiliseres ved tilstedeværelsen af en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). I modsætning til andre inducible metoder kan dette system let tilpasses til at generere bi-cistronic-systemer til at udtrykke DD-Cas9 med et andet gen af interesse uden betinget regulering af det andet gen. Denne metode gør det muligt at generation af sporbare systemer samt parallel, uafhængig manipulation af alleler målrettet af Cas9 nuklease. Platformen for denne metode kan bruges til systematisk identifikation og karakterisering af essentielle gener og forhør af de funktionelle interaktioner mellem gener i in vitro- og in vivo-indstillinger.
Introduction
CRISPR-Cas9, som står for “grupperet regelmæssigt interspaced kort palindromisk gentager-associeret protein 9” blev først opdaget som en del af undersøgelser af bakteriel adaptiv immunitet1,2. I dag er CRISPR/Cas9 blevet det mest anerkendte værktøj til programmerbar genredigering, og der er udviklet forskellige gentagelser af systemet for at muliggøre transskriptionelle og epigenetiske modulationer3. Denne teknologi muliggør den meget præcise genmanipulation af næsten enhver sekvens af DNA4.
De væsentlige komponenter i enhver CRISPR-genredigering er en tilpasselig guide RNA-sekvens og Cas9-kerne5. RNA-føringen binder sig til den mål komplementære sekvens i DNA’et og leder Cas9-kernen til at udføre en dobbeltstrengsbrud på et bestemt punkt i genomet3,4. Det resulterende kavalergangssted repareres derefter af ikke-homolog end-join (NHEJ) eller homologi-rettet reparation (HDR) med den deraf følgende indførelse af ændringer i den målrettede DNA-sekvens5.
CRISPR/Cas9-baseret genredigering er nem at bruge og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker , og det har vist sig at være både effektivt og robust i en mangfoldighed af systemer2,4,5. Alligevel indeholder systemet nogle begrænsninger. Det konstituerende udtryk for Cas9 har ofte vist sig at resultere i et øget antal off-targets og højcelletoksicitet 4,6,7,8. Derudover tager cas9’s konstituerende målretning af essentielle og celleoverlevelsesgener væk fra dets evne til at udføre visse typer funktionelle undersøgelser såsom kinetiske undersøgelser af celledød7.
Der er udviklet forskellige induktions- eller betinget kontrollerede CRISPR-Cas9-værktøjer til løsning af disse spørgsmål6, såsom Tet-ON og Tet-Off9; lokalitetsspecifik rekombination10; kemisk induceret nærhed11; inteinafhængig splejsning3; og 4-Hydroxytamoxifen Østrogen Receptor (ER) baserede nukleare lokaliseringssystemer12. Generelt giver de fleste af disse procedurer (intein splejsning og kemisk inducerede nærhedssplitsystemer) ikke reversibel kontrol, udgør en meget langsom kinetisk reaktion på narkotikabehandling (Tet-On/Off-system) eller kan ikke aktiveres til manipulation med høj gennemstrømning6.
For at løse disse begrænsninger udviklede vi et nyt værktøjssæt, der ikke kun giver hurtig og robust tidsstyret genredigering, men også sikrer sporbarhed, tunabilitet og imødekommelse til høj gennemløbsgenmanipulation. Denne nye teknologi kan bruges i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Vores system er baseret på et manipuleret domæne, når det smeltes sammen til Cas9, det fremkalder en hurtig nedbrydning. Det kan dog hurtigt stabiliseres med et meget selektivt, ikke-giftigt, celletrængeligt lille molekyle. Mere specifikt, vi manipuleret den menneskelige FKBP12 mutant “destabiliserende domæne” (DD) til Cas9, mærkning Cas9 for hurtig og konstituerende nedbrydning via ubiquitin-proteasome system, når udtrykt i pattedyr celler13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD kropsbygning, og dermed forhindre nedbrydning af proteiner smeltet til DD (såsom Cas9) på en meget effektiv måde, og med en hurtig kinetiskreaktion 14,15. Bemærk, Shield-1 binder med tre størrelsesordener strammere til mutant FKBP12 end til sin vilde type modstykke14.
DD-Cas9/Shield-1-parret kan bruges til at studere systematisk identifikation og karakterisering af essentielle gener i dyrkede celler og dyremodeller, som vi tidligere har vist ved betinget at målrette CypD-genet, som spiller en vigtig rolle i metabolismen af mitokondrier; EGFR, en nøglespiller i onkogen transformation; og Tp53, et centralt gen i DNA-skaderespons. Ud over tidsmæssigt og betinget kontrolleret genredigering er en anden fordel ved metoden, at stabiliseringen af DD-Cas9 er uafhængig af transskriptionen. Denne funktion gør det muligt co-udtryk, under samme promotor, af sporbare markører samt rekombinisser, såsom østrogen receptor-afhængige rekombininase, CREER. I dette arbejde viser vi, hvordan vores metode med succes kan bruges in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikationsgen, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9-teknologien har revolutioneret evnen til funktionelt at afhøre genomer2. Inaktivering af gener resulterer imidlertid ofte i celledødelighed, funktionelle underskud og udviklingsdefekter, hvilket begrænser nytten af sådanne tilgange til undersøgelse af genfunktioner7. Desuden kan det konstituerende udtryk for Cas9 resultere i toksicitet og generering af virkninger uden for målet6. Der er udviklet forskellige tilgange til tidsmæssig …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker tidligere medlemmer af vores laboratorium og videnskabsmand Serif Senturk for tidligere arbejde. Vi takker Danilo Segovia for kritisk læsning af dette manuskript. Denne undersøgelse var mulig og støttet af Swim Across America og National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center program.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
