सशर्त Cas9 स्थिरीकरण का उपयोग कर जीन कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक नया टूलकिट
Summary
यहां, हम छोटे अणु, शील्ड-1 के तहत क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट-(CRISPR-) संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) के लौकिक और सशर्त स्थिरीकरण के आधार पर एक जीनोम-संपादन उपकरण का वर्णन करते हैं । विधि सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
संकुल नियमित रूप से लघु palindromic दोहराने-(CRISPR-) संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रौद्योगिकी जीनोम में सटीक और लक्षित संशोधनों को लागू करने के लिए एक प्रचलित प्रयोगशाला उपकरण बन गया है । इसकी भारी लोकप्रियता और तेजी से प्रसार अपने पूर्ववर्तियों की तुलना में इसके आसान उपयोग और सटीकता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। फिर भी, प्रणाली के संविलियन सक्रियण के पास सीमित अनुप्रयोग हैं। इस पेपर में, हम एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो Cas9 प्रोटीन के सशर्त स्थिरीकरण के आधार पर CRISPR/Cas9 गतिविधि के लौकिक नियंत्रण की अनुमति देता है । रैपामाइसिन-बाइंडिंग प्रोटीन FKBP12 के एक इंजीनियर उत्परिवर्ती को Cas9 (डीडी-Cas9) में फ्यूज करने से Cas9 की तेजी से गिरावट में सक्षम बनाता है कि बदले में FKBP12 सिंथेटिक लिगांड (शील्ड-1) की उपस्थिति से स्थिर किया जा सकता है। अन्य प्रेरक तरीकों के विपरीत, इस प्रणाली को आसानी से दूसरे जीन के सशर्त विनियमन के बिना, रुचि के एक और जीन के साथ डीडी-Cas9 को सह-एक्सप्रेस करने के लिए द्वि-सिस्ट्रोनिक सिस्टम उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह विधि ट्रेस करने योग्य प्रणालियों के उत्पादन के साथ-साथ Cas9 नाभिक द्वारा लक्षित एलील्स के समानांतर, स्वतंत्र हेरफेर को सक्षम बनाती है। इस विधि के मंच का उपयोग आवश्यक जीनों की व्यवस्थित पहचान और लक्षण वर्णन और इन विट्रो और वीवो सेटिंग्स में जीन के कार्यात्मक इंटरैक्शन की पूछताछ के लिए किया जा सकता है।
Introduction
CRISPR-Cas9 जो “के लिए खड़ाहै” क्लस्टर नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता से जुड़े प्रोटीन 9” पहली बार बैक्टीरियल अनुकूली प्रतिरक्षा1, 2पर अध्ययन के भाग के रूप में खोजा गया था । आज, CRISPR/Cas9 प्रोग्राम करने योग्य जीन संपादन के लिए सबसे अधिक मान्यता प्राप्त उपकरण बन गया है और प्रतिलेखन और एपिजेनेटिक मॉड्यूलेशन3की अनुमति देने के लिए प्रणाली के विभिन्न पुनरावृत्तियों को विकसित किया गया है। यह तकनीक डीएनए4के लगभग किसी भी अनुक्रम के अत्यधिक सटीक आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम बनाती है ।
किसी भी CRISPR जीन संपादन के आवश्यक घटक एक अनुकूलन गाइड आरएनए अनुक्रम और Cas9 नाभिक5हैं । आरएनए गाइड डीएनए में लक्ष्य-पूरक अनुक्रम को बांधता है, जो Cas9 नाभिक को जीनोम3, 4में एक विशिष्ट बिंदु पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक करने कानिर्देशदेता है। परिणामस्वरूप दरार साइट तो गैर अनुरूप अंत में शामिल होने (NHEJ) या होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (HDR) द्वारा मरंमत की है, लक्षित डीएनए अनुक्रम5में परिवर्तन की शुरूआत के परिणामस्वरूप ।
CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन का उपयोग करना आसान है, और पिछले जीन-संपादन तकनीकों की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ती है औरयह सिस्टम2,4,5की बहुलता में कुशल और मजबूत दोनों साबित हुआ है। फिर भी, प्रणाली कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है। Cas9 की संविलियन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप अक्सर ऑफ-टारगेट और उच्च कोशिका विषाक्तता 4,6 ,7,8की संख्या में वृद्धि हुई है। इसके अतिरिक्त, Cas9 द्वारा आवश्यक और कोशिका अस्तित्व जीन का संविलियन लक्ष्यीकरण कुछ प्रकार के कार्यात्मक अध्ययनों जैसे कि कोशिका मृत्यु के गतिज अध्ययन ों को करने की क्षमता से दूर लेजाताहै।
टीईटी-ऑन और टीईटी-ऑफ9जैसे 6 मुद्दों के समाधान के लिए विभिन्न अक्षाकीय यासशर्तनियंत्रित CRISPR-Cas9 उपकरण विकसित किए गए हैं; साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन10; रासायनिक रूप से प्रेरित निकटता11; इंटीरीन निर्भर3; और 4-हाइड्रोक्सीटामोक्सिफेन एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) आधारित न्यूक्लियर लोकलाइजेशन सिस्टम12। सामान्य तौर पर, इनमें से अधिकांश प्रक्रियाएं (इंटीरिन स्प्लिसिंग और रासायनिक रूप से प्रेरित निकटता विभाजन प्रणाली) रिवर्सिबल नियंत्रण प्रदान नहीं करती हैं, दवा उपचार (टीईटी-ऑन/ऑफ सिस्टम) के लिए बहुत धीमी गतिज प्रतिक्रिया पेश करती हैं, या उच्च-थ्रूपुट हेरफेर6के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए हमने एक उपन्यास टूलकिट विकसित किया जो न केवल तेज और मजबूत लौकिक नियंत्रित जीन संपादन प्रदान करता है बल्कि उच्च थ्रूपुट जीन हेरफेर के लिए पता लगाने की क्षमता, ट्यूनेबिलिटी और योग्यता भी सुनिश्चित करता है। इस उपन्यास तकनीक का उपयोग सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड और पशु मॉडल में किया जा सकता है। हमारी प्रणाली एक इंजीनियर डोमेन पर आधारित है, जब Cas9 से जुड़े, यह अपनी तेजी से गिरावट लाती है । हालांकि, यह तेजी से एक अत्यधिक चयनात्मक, गैर विषाक्त, सेल पार पार पार करने योग्य छोटे अणु के साथ स्थिर किया जा सकता है । अधिक विशेष रूप से, हमने मानव FKBP12 उत्परिवर्ती “अस्थिर डोमेन” (डीडी) को Cas9 में इंजीनियर किया, जो स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त होने पर सर्वव्यापी-प्रोटीसोम प्रणाली के माध्यम से तेजी से और संविलियन क्षरण के लिए Cas9 को चिह्नितकरताहै। डीडी सिंथेटिक लिगांड, शील्ड-1 डीडी संरचना को स्थिर कर सकता है, जिससे डीडी (जैसे Cas9) को बहुत ही कुशल तरीके से और तेजी से गतिज प्रतिक्रिया14, 15के साथ प्रोटीन के क्षरण को रोकाजासकता है। ध्यान दें, शील्ड-1 अपने जंगली प्रकार के समकक्ष14की तुलना में उत्परिवर्ती FKBP12 के लिए सख्त परिमाण के तीन आदेश के साथ बांधता है ।
डीडी-Cas9/शील्ड-1 जोड़ी का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु मॉडलों में आवश्यक जीन की व्यवस्थित पहचान और लक्षण वर्णन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि हमने पहले सिपड जीन को सशर्त लक्षित करके दिखाया था, जो माइटोकॉन्ड्रिया के चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; ईजीएफआर, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन में एक प्रमुख खिलाड़ी; और Tp53, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में एक केंद्रीय जीन । अस्थायी और सशर्त नियंत्रित जीन संपादन के अलावा, विधि का एक और लाभ यह है कि डीडी-Cas9 का स्थिरीकरण इसके प्रतिलेखन से स्वतंत्र है। यह सुविधा एक ही प्रमोटर के तहत, ट्रेस करने योग्य मार्कर के साथ-साथ रिकॉम्बिनेंटस के सह-अभिव्यक्ति को सक्षम बनाती है, जैसे एस्ट्रोजन रिसेप्टर-निर्भर रिकॉम्बेनेस,सीआरई ईआर। इस काम में, हम दिखाते हैं कि कैसे हमारी विधि को सफलतापूर्वक विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए सशर्त लक्ष्य, डीएनए प्रतिकृति जीन, RPA3।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी ने जीनोम2से कार्यात्मक रूप से पूछताछ करने की क्षमता में क्रांतिकारी बदलाव किया है । हालांकि, जीन की निष्क्रियता के परिणामस्वरूप अक्सर कोशिका घातकता, कार्यात्मक घाटे और विक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पिछले काम के लिए हमारी प्रयोगशाला और वैज्ञानिक सेरिफ सेंटुर्क के पिछले सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि को समीक्षकों द्वारा पढ़ने के लिए डैनिलो सेगोविया को धन्यवाद देते हैं । यह अध्ययन संभव था और अमेरिका भर में तैरना और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर लक्ष्य डिस्कवरी और विकास केंद्र कार्यक्रम द्वारा समर्थित ।
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
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