Analys av icke-mänskliga primater bukspottskörteln ö syreförbrukning
Summary
Detta protokoll visar korrekt och reproducerbar mätning av syreförbrukning i icke-mänskliga primater pankreasöar. Den holme lastning tekniker och beläggning av mikroplattan ger en ram för effektiv mätning av andning i andra typer av odlade spheroids.
Abstract
Mätningen av syreförbrukning i sfäroid kluster av celler, såsom ex vivo pankreasöar, har historiskt varit utmanande. Vi visar mätning av ös syreförbrukning med hjälp av en 96-brunn mikroplatta avsedd för mätning av syreförbrukning i spheroids. I denna analys, sfäroid mikroplattor är belagda med en cell och vävnad lim på dagen före analysen. Vi använder en liten volym av limlösning för att uppmuntra Holmen anslutning till endast botten av brunnen. På dagen för analysen, 15 öar lastas direkt i basen av varje brunn med hjälp av en teknik som garanterar optimal positionering av holkar och noggrann mätning av syreförbrukning. Olika aspekter av mitokondriell andning sonderade farmakologiskt i icke-mänskliga primater öar, inklusive ATP-beroende andning, maximal andning, och Proton läcka. Denna metod möjliggör konsekventa, reproducerbara resultat med endast ett litet antal holkar per brunn. Det kan teoretiskt tillämpas på alla odlade spheroids av liknande storlek.
Introduction
För att bibehålla normala blodglukosnivåer, bukspottskörteln β-cellen måste känna förhöjning av glukos och utsöndra insulin i enlighet därmed. Kopplingen av insulinsekretion med glukosnivåer är direkt kopplad till glukosmetabolismen och produktionen av ATP genom mitokondriell oxidativ fosforylering. Således, mitokonan spela en kritisk roll i stimulans-sekretion koppling1. Bedömning av β-cells mitokondriefunktion kan avslöja defekter som leder till försämrad insulinsekretion. Utsöndringen av glukagon av α-celler i bukspottskörteln är också nära knuten till mitokondriell funktion2. Även om förevigade ö-cellinjer har visat sig användbara för vissa typer av analyser, fysiologin i dessa celler inte exakt recapitulate hela Holmen funktion, vilket illustreras av potentiering av insulinsekretion av glukagon3,4 och hämning av glukagon sekretion av insulin/somatostatin5,6 i intakt öar. Detta visar på behovet av att mäta syreförbrukningen med hjälp av hela, intakt öar.
Tekniker för mätning av ö-cell respirometri har utvecklats med tiden, från användning av syre-känsligt fluorescerande färgämnen7 till solid-state sensorer som direkt mäter syreförbrukning8. Ursprungligen avsedd för monolayer, anhängare celler, vanligen används cellkultur plattan system har visat sig vara ineffektiva för pankreasöar. Eftersom kobbar inte naturligt följa brunnar, de är benägna att pressas till periferin av kulturen väl resulterar i felaktig mätning av syreförbrukning9. För att bekämpa detta problem, specialiserade 24-well tallrikar med en central depression som kunde innehålla holkar utvecklades9. Men den 24-well plattan systemet begränsades av det stora antalet öar som krävs (50-80 per brunn) och antalet villkor som skulle kunna testas samtidigt10. Den senaste utvecklingen av 96-väl mikroplattor som utformats speciellt för extracellulär Flux analys i spheroids har övervinna dessa hinder, vilket möjliggör mätning av ö respirometri med 20 eller färre holkar per brunn10.
Här demonstrerar vi användandet av detta system för att mäta syreförbrukning i skär från japansk makak (Macaca fuscata), en djurmodell med liknande ö-biologi till människor11,12. I detta protokoll analyseras 15 makak-öar per brunn. 15 öar per brunn producerade i våra händer högre syreförbrukning Vidbaslinjen än färre öar, med robust aktivering och förtryck av andning som svar på farmakologisk manipulation. Vi belyser stegen för att förbereda för analysen, en effektiv metod för konsekvent lastning av öar i mitten av varje brunn, och gemensamma utmaningar när de utför denna analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet av ön syreförbrukning har tidigare hämmats av den sfäriska formen av öar, deras bristande följsamhet till kulturen ytor, och antalet öar som krävs per brunn. I detta protokoll lyfter vi fram effekten av 96-och sfäroid-mikroplattan för mätning av ö-syreförbrukning på ett litet antal holkar och uppvisar en teknik för hantering och lastning av öar som är tekniskt genomförbara och som ger konsekvent Resultat.
För att kobbar ska hålla sig till botten av mikroplattan och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja erkänna Vanderbilt hög genomströmning screening kärna för användning av deras anläggningar, Agilent bio Technologies, Dr Paul Kievit (Oregon Health and Science University) för icke-mänskliga primater ö isoleringar, och Eric Donahue (Vanderbilt University) för hjälp med figur 1. J.M.E. stöddes av NIGMS av National Institutes of Health under tilldelnings nummer T32GM007347. M.G. stöddes av NIH/NIDDK (R24DK090964-06) och avdelningen för Veterans Affairs (BX003744).
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D’Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology–Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP’s ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
