Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales
En este artículo
Resumen
Resumen
El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.
Introducción
En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas1. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los pasos del procedimiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT).
ADVERTENCIA: Depositar todos los medios que contengan microbios patógenos, así como las plantas y el tejido vegetal utilizados en el ensayo, en los contenedores de residuos y autoclave apropiados antes de desechar.
1. Preparación de construcciones de plásmidos que contengan efectos putativos
- Seleccione los efectores secretos putativos que están altamente expresados durante la infección, según lo determinado por la secuenciación de ARN (RNA-Seq), y más por la técnica cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR). <....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Arriba, describimos el procedimiento paso a paso para un ensayo de cribado mejorado para evaluar la actividad RSS de los efectores De P. sojae RxLR. En total, el experimento toma de 5 a 6 semanas. Posteriormente, los RSS identificados por el ensayo pueden caracterizarse aún más en términos de función y mecanismo molecular. Como ejemplo de nuestro enfoque, utilizamos el supresor Phytophthora de P. sojae RxLR effecto de silenciamiento de ARN 1 (PSR1), que se secreta y se e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS10.<.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del "Programa Shuguang" de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái, el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China Programa Nacional de I+D Clave de China ( 2018YFD0201500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.o 31571696 y 31660510), el Programa de Mil Talentos para Jóvenes Profesionales de China, y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (18DZ2260500).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Tampón |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morfolino) ácido propanosulfónico (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Tampón |
| acetosiringona (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Inducción de |
| agar | AgrobacteriumSigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medio |
| Agarosa | Biofroxx | 1110GR100 | Electroforesis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medio |
| Bacto Extracción | de levaduraBD Biosciences | 212750 | LB |
| Cámara | Nikon | D5100 | Fotografía |
| ChemiDoc MP Sistema de imagen | Bio-Rad | ||
| Módulo de detección quimioluminiscente componente de los kits dafa | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Detección de luminiscencia |
| Cloranfenicol | Amresco | 0230-100G | Antibióticos |
| ClonExpress II Kit de clonación en un solo paso | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligadura |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Tampón de hibridación |
| Easypure Kit de minipreparación de plásmidos | TransGen Biotech | EM101-02 | Extracción de plásmidos |
| EasyPure Kit de extracción rápida de gel | TransGen Biotech | EG101-02 | Extracción de gel |
| EDTA sal disódica dihidratada | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Fuente |
| alimentación de electroforesis | LiuYi | DYY6D | Electroforesis de ácido nucleico. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Digestión vectorial |
| Sistema de imagen en gel Tanon | Tanon3500 | Imagen | |
| Gentamicina | Amresco | 0304-5G | Antibióticos |
| Sulfato de kanamicina | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibióticos |
| LR Enzima clonasa II | Invitrogen | 11791020 | Reacción |
| LRNitrocelulosa Membrana secante 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south Kit de etiquetado de ADN de primera calidad aleatorio de biotina | Thermo Fisher Scientific | 17075 | etiquetado de biotina |
| Termocicladores | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Turba | PINDSTRUP | Oro oscuro + arcilla | Plantas |
| Peters Fertilizante soluble en agua | ICE | Peter Fertilizante profesional 20-20-20 | |
| Phanta Max ADN polimerasa de superfidelidad | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzima |
| rifampicina | MP Biomedicals | 219549005 | antibióticos |
| Tinte de carga de gel de ARN (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | Tinte de carga de gel de ARN |
| Acetato de sodio Tampón | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS |
| Cloruro de sodio | Amresco | 0241-10KG | LB medio |
| Citrato trisódico | Amresco | 0101-1KG | SSC Tampón |
| Trizol Reactivo | Invitrogen 15596018 | reactivo de aislamiento de ARN | |
| Analytik Jena | UVP B-100AP | Observación | |
| UVP Horno Hybrilinker | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Referencias
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
