Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Summary

Durchbruchskurven (BTCs) sind effiziente Werkzeuge, um den Transport von Bakterien in porösen Medien zu untersuchen. Hier stellen wir Werkzeuge auf Basis von Fluidgeräten in Kombination mit Mikroskopie und Zytometrischer Durchflusszählung vor, um BTCs zu erhalten.

Abstract

Das Verständnis des Transports, der Dispersion und der Ablagerung von Mikroorganismen in porösen Medien ist eine komplexe wissenschaftliche Aufgabe, die so unterschiedliche Themen wie Hydrodynamik, Ökologie und Umwelttechnik umfasst. Die Modellierung des bakteriellen Transports in porösen Umgebungen in unterschiedlichen räumlichen Maßstäben ist entscheidend, um die Folgen des bakteriellen Transports besser vorherzusagen, doch aktuelle Modelle verfehlen es oft, von Labor zu Feldbedingungen zu skalieren. Hier stellen wir experimentelle Werkzeuge vor, um den bakteriellen Transport in porösen Medien in zwei räumlichen Maßstäben zu untersuchen. Ziel dieser Werkzeuge ist es, makroskopische Beobachtungen (wie Durchbruchkurven oder Abscheidungsprofile) von Bakterien zu erhalten, die in transparente poröse Matrizen injiziert werden. Im kleinen Maßstab (10-1000 m) werden mikrofluidische Geräte mit optischer Videomikroskopie und Bildverarbeitung kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten und gleichzeitig einzelne Bakterienzellen im Porenmaßstab zu verfolgen. In größerem Maßstab wird die Durchflusszytometrie mit einem selbstgebauten Roboterspender kombiniert, um bahnbrechende Kurven zu erhalten. Wir veranschaulichen den Nutzen dieser Werkzeuge, um besser zu verstehen, wie Bakterien in komplexen porösen Medien wie der hyporhoischen Zone von Strömen transportiert werden. Da diese Werkzeuge simultane Messungen über Skalen hinweg ermöglichen, ebnen sie den Weg für mechanismusbasierte Modelle, die für die Hochskalierung von entscheidender Bedeutung sind. Die Anwendung dieser Werkzeuge kann nicht nur zur Entwicklung neuartiger Biosanierungsanwendungen beitragen, sondern auch ein neues Licht auf die ökologischen Strategien von Mikroorganismen werfen, die poröse Substrate besiedeln.

Introduction

Studien, die darauf abzielen, den Transport von Mikroben durch poröse Medien zu verstehen, wurden hauptsächlich durch Bedenken der Kontamination¹, der Übertragung von Krankheit² und der Biosanierung^{3 getrieben.} In dieser Hinsicht wurden Bakterien in den Transportmodellen⁴ meist als Partikel behandelt und Prozesse wie Filtration, Belastung, Gravitationsabsetzen oder Remobilisierung aus Biofilmen wurden als Treiber der Retention oder des Transports von Mikroben identifiziert⁵. Die Untersuchung des Transports von Bakterien durch poröse Landschaften kann uns jedoch auch über die ökologischen Strategien informieren, die ihren Erfolg in diesen komplexen Umgebungen untermauern. Dies erfordert jedoch neuartige Experimente und mathematische Modelle, die auf der Ebene der Einzelzellen, der Population oder der mikrobiellen Gemeinschaft funktionieren.

Natürliche poröse Umgebungen, wie sie in der hyporhoischen Zone von Bächen und Flüssen gefunden werden, werden von verschiedenen Gemeinschaften von biofilmbildenden Mikroben dicht besiedelt⁶. Biofilme bilden Strukturen, die den Fluss und damit den Transport und die Dispersion von Bakterien in der flüssigen Phase^7,8verändern. Der Transport von Bakterien im Porenmaßstab hängt von der begrenzten Raumverfügbarkeit in der porösen Matrix ab und die mit Dermotilität zusammenhängende Dispersion kann ein effektiver Weg sein, um die individuelle Fitness durch einen geringeren Wettbewerb um Ressourcen in weniger dicht besiedelten Gebieten zu erhöhen. Auf der anderen Seite können motile Bakterien auch mehr isolierte Regionen der porösen Matrix erreichen und die erweiterte Erforschung solcher Gebiete kann ökologische Möglichkeiten für motile Populationen bieten¹⁰. Bei größeren räumlichen Maßstäben lenkt das Biofilmwachstum die Strömungswege um, was auch zu (teilweiser) Verstopfung der Poren und damit zur Etablierung noch kanalisierterer und heterogener Strömungsbedingungen¹¹führt. Dies hat Folgen für die Nährstoffversorgung und Diedispersionskapazität, Frequenz und Entfernung. Bevorzugter Fluss kann beispielsweise sogenannte “Fast-Tracks” erzeugen und motile Bakterien können noch höhere Geschwindigkeiten erreichen als der lokale Fluss entlang dieser Bahnen¹². Dies ist ein effektiver Weg, um die Erforschung neuer Lebensräume zu erhöhen.

Eine Vielzahl von Werkzeugen nutzen sich für die Untersuchung des Transports von motilen und nicht-motilen Bakterien (und Partikeln) in porösen Medien. Numerische Modelle haben große Vorhersagekapazitäten, die für Anwendungen wichtig sind, werden jedoch oft durch inhärente Annahmen eingeschränkt⁴. Laborexperimente^13,14 kombiniert mit der Modellierung von Bahnbrechenden Kurven (BTC) haben wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung bakterieller Zelloberflächeneigenschaften für die Hafteffizienz¹⁵geliefert. Typischerweise werden BTCs (d. h. Malreihen der Partikelkonzentration an einem festen Ort) durch konstante Freisetzungen und Messung der Zellzahlen am Abfluss des Versuchsgeräts erhalten. In diesem Zusammenhang spiegeln BTCs die Advektions-Dispersionsdynamik von Bakterien in der porösen Matrix wider und können durch einen Senketerm erweitert werden, der die Anhaftung berücksichtigt. Die Modellierung von BTCs allein löst jedoch nicht die Rolle der räumlichen Organisation des porösen Substrats oder Biofilms für Transportprozesse auf. Andere makroskopische Beobachtungswerte wie Dispergivität oder Ablagerungsprofile liefern nachweislich wichtige Informationen über die räumliche Verteilung oder die zurückgehaltenen Teilchen oder wachsenden Gemeinschaften. Mikrofluidik ist eine Technologie, die das Studium des Transports in porösen Medien durch Mikroskopie Untersuchung^9,12,16ermöglicht, und außer einer kürzlichen Arbeit¹⁰, experimentelle Systeme sind in der Regel auf eine einzelne Längenskala der Auflösung beschränkt, das heißt, die Porenskala oder die gesamte Fluidgeräteskala.

Hier stellen wir eine Reihe kombinierter Methoden vor, um den Transport von motilen und nicht-motilen Bakterien in porösen Landschaften in verschiedenen Maßstäben zu untersuchen. Wir kombinieren Beobachtungen des bakteriellen Transports auf der Porenskala mit Informationen in größerem Maßstab, mittels BTC-Analysen. Mikrofluidische Geräte aus weicher Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS) sind biokompatibel, resistent gegen eine Reihe von Chemikalien, ermöglichen Einereproduzierlichkeit zu niedrigen Kosten und bieten eine hervorragende optische Transparenz sowie eine geringe Autofluoreszenz, die für die mikroskopische Beobachtung entscheidend ist. Mikrofluidik auf Basis von PDMS wurde bisher verwendet, um den Transport von Mikroben in einfachen Kanälen¹⁷ oder in komplexeren Geometrien¹²zu untersuchen. Typischerweise konzentrieren sich Mikrofluidik-Experimente jedoch auf kurzfristige Horizonte, und die mikroskopische Beobachtung lebender Zellen durch Epifluoreszenz ist häufig auf genetisch veränderte Stämme (z. B. GFP-markierte Stämme) beschränkt. Hier stellen wir Werkzeuge zur Untersuchung des bakteriellen Transports mit MIKROfluidischen PDMS-basierten Geräten in Kombination mit Mikroskopie und größeren Geräten aus Poly (Methylmethacrylat) (PMMA, auch Plexiglas genannt) in Kombination mit Durchflusszytometrie vor. PDMS und PMMA unterscheiden sich in der Gasdurchlässigkeit und Oberflächeneigenschaften und bieten so ergänzende Möglichkeiten, den bakteriellen Transport zu untersuchen. Während das mikrofluidische Gerät eine kontrolliertere Umgebung bietet, ermöglicht das größere Gerät Experimente über einen längeren Zeitraum oder die Verwendung natürlicher Bakteriengemeinschaften. Die Mikroskopiezählung mit hoher zeitlicher Auflösung in einem speziellen Bereich wird verwendet, um BTC im PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät zu erhalten. Um die Anzahl der Zellen für die BTC-Modellierung vom PMMA-basierten Gerät zu erhalten, führen wir einen selbstkonstruierten automatisierten Flüssigkeitsspender in Kombination mit Durchflusszytometrie ein. Bei diesem Setup passieren die Zellen das Fluidgerät und werden nacheinander in 96 Brunnenplatten abgegeben. Die zeitliche Auflösung wird durch das minimale Volumen, das genau abgegeben werden kann, und damit die mittlere Durchflussrate durch das Fluidgerät eingeschränkt. Fixativ in den Brunnen verhindert Wachstum und erleichtert DIE DNA-Färbung für die nachgeschaltete strömungszytometrische Enumeration. Um das Bakterienwachstum bei Transportexperimenten zu verhindern, verwenden wir einen minimalen mittelmäßigen Motilitätspuffer.

Da Protokolle zur Herstellung von Fluidgeräten in verschiedenen Maßstäben leicht verfügbar sind, führen wir nur kurz die Techniken zur Herstellung solcher Geräte ein und konzentrieren uns vielmehr auf die experimentellen Verfahren zur Aufzeichnung von BTCs. In ähnlicher Weise gibt es verschiedene Routinen für die zytometrische Aufzählung von Mikroben durch die Durchfluss- und Benutzer benötigen Expertenwissen, um die ergebnisse zu interpretieren, die durch die Durchflusszytometrie erzielt werden. Wir berichten über den neuartigen Einsatz von mikrofluidischen Geräten in Kombination mit mikroskopischer Bildgebung, um BTCs von fluoreszierend markierten Zellen aufzuzeichnen. Auf der Porenskala werden lokale Geschwindigkeiten und Flugbahnen mittels Bildverarbeitung ermittelt. Darüber hinaus zeigen wir den Einsatz eines PMMA-basierten Fluidgeräts in Kombination mit strömungszytometrischer Zählung, um den bakteriellen Transport von motilen und nicht-motilen Zellen in porösen Umgebungen zu beobachten, die durch einen nativen Strombiofilm besiedelt sind.

Protocol

1. Bakterielle Kulturbedingungen Verwenden Sie unter einer laminaren Durchflusshaube 100 l eines Glyzerinbestands von Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, bei -80 °C gelagert), um 5 ml Luria-Bertani (LB) Medium zu impfen. Bei 30 °C inkubieren und über Nacht bei 250 Umdrehungen schütteln. Am nächsten Tag 100 l der Übernachtungskultur in 5 ml LB-Medium wieder aufheben und unter den gleichen Bedingungen für 5h (exponentielle Phase) inkubieren. Ein 1 ml Aliquot i…

Representative Results

Um die Funktionalität des vorgestellten Workflows zu veranschaulichen, führten wir Experimente mit dem gentechnisch veränderten Pseudomonas putida KT2440 durch, einem gramnegativen motile Bakterium, das für die Biosanierung und Biotechnologie wichtig ist. Gentechnisch veränderte Versionen dieses Stammes, die die GFP-Produktion ausdrücken, sind im Handel erhältlich. Ein nicht-motiler Stamm von P. putida KT2440, dem die relevanten strukturellen und regulatorischen G…

Discussion

Hier schlagen wir zwei Mittel vor, um den Transport von Mikroben durch poröse Systeme auf Einzelzell- und Populationsebene zu untersuchen. Während die Untersuchung von Transportphänomenen mit Hilfe von BTC-Modellierung wertvolle Erkenntnisse über die Ausbreitung von Krankheitserregern oder Kontaminanten auf den Ökosystemskalen lieferte, gibt es nach wie vor Schwierigkeiten, von Laborexperimenten bis hin zu Feldbedingungen zu skalieren. Die hier beschriebenen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, die räumlichen u…

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron