Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

Summary

Décrit ici est l'utilisation d'une méthode d'amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L'ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.

Abstract

L'amplification de sonde spécifique à la méthylation (MSPA) est une technique simple et robuste qui peut être utilisée pour détecter les différences relatives dans les niveaux de méthylation des échantillons d'ADN. Il est débrouillard, nécessite de petites quantités d'ADN, et prend environ 4 à 5 h de travail pratique. Dans la technique présentée, les échantillons d'ADN sont d'abord dénaturés puis hybridés en sondes qui ciblent l'ADN à des sites méthylés ou de référence comme un contrôle. L'ADN hybride est séparé en réactions parallèles, l'une subissant seulement la ligature et l'autre subissant la ligature suivie de la digestion HhaI-négociée aux séquences non méthylées de GCGC. Les fragments d'ADN qui en résultent sont amplifiés par PCR et séparés par l'électrophorèse capillaire. Les sites GCGC méthylés ne sont pas digérés par HhaI et produisent des signaux de pointe, tandis que les sites GCGC non méthylés sont digérés et aucun signal de pointe n'est généré. La comparaison des pics normalisés de contrôle des versions digérées et non digérées de chaque échantillon fournit le rapport de dosage de méthylation d'un échantillon d'ADN. Ici, MSPA est utilisé pour détecter les effets des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome (VE) sur le statut de méthylation de l'élément nucléaire entrecoupé à long (LINE-1) dans les cellules souches mésenchymales. Les LINE-1 sont des éléments d'ADN répétitifs qui subissent généralement une hypométhylation dans le cancer et, à ce titre, peuvent servir de biomarqueur. L'ultracentrifugation est également utilisée comme méthode rentable pour séparer les vésicules extracellulaires des fluides biologiques (c.-à-d. lors de la préparation du sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques [FBS] et de l'isolation des VE à partir des médias conditionnés par l'ostéosarcome [centrifugation différentielle]). Pour l'analyse de méthylation, les sondes LINE-1 personnalisées sont conçues pour cibler trois sites de méthylation dans la séquence de promoteur LINE-1 et sept sites de contrôle. Ce protocole démontre l'utilisation de MSPA pour l'analyse de méthylation LINE-1 et décrit la préparation de LA SF APPAUVRIe par ultracentrifugation.

Introduction

La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique majeure qui se produit dans les cellules humaines. La méthylation de l'ADN fait référence au lien entre les groupes méthyliques et les résidus de cytosine dans les dinuccléotides du CpG. De tels dinucleotides se trouvent habituellement dans les grappes (îles CpG) à la région de 5' des gènes¹. Dans les cellules normales, la plupart de ces dinucléotides existent dans un état non méthylé, ce qui permet la transcription de l'ADN. Incidemment, de nombreux cancers sont associés à des îles cpG hyperméthylées et au silençage transcriptomique², en particulier dans les gène....

Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique d'Helsinki et le district hospitalier d'Uusimaa (approbation éthique D. No. 217/13/03/02/2015).

1. Préparation de FBS EV-appauvri par ultracentrifugation

1. Prenez FBS dans des tubes (ultra)centrifugeurs et placez-les dans des seaux ultracentrifuges. Pour s'assurer que l'ultracentrifugation fonctionne sans heurts et en toute sécurité, équilibrez les seaux à moins de 10 mg les uns des autres.
2. Chargez les seaux sur un rotor oscillant (type SW28, k-facteur 246). Placer le rotor dans l'ultracentrifuge et courir à 100 000 x g pendant 19 h à 4 oC.
3. Recueillir s....

Results

L'objectif principal de cette étude était d'évaluer les effets épigénétiques des OS-VE sur les MSC. OS-VE ont été isolés à partir de cellules HOS-143B en utilisant la méthode standard de centrifugation différentielle. L'expression des marqueurs EV typiques CD63, Hsp70 et TSG101 par le ballonnement occidental a confirmé la présence d'OS-EV. (Figure 2A). L'absence de signal de calnexin a indiqué la pureté de l'isolat d'OS-EV. D'autres indications de pureté ont été observées av.......

Discussion

Cette étude illustre comment MSPA peut être utilisé pour détecter et quantifier le statut de méthylation d'un élément génétique spécifique. LINE-1 a été l'objet ici, mais les sondes peuvent être conçues pour cibler une gamme de gènes et de séquences. En outre, il existe une liste croissante de mélanges de sondes disponibles pour différentes applications. MSPA est une technique simple et robuste pour l'analyse de méthylation de l'ADN qui ne nécessite pas de conversion bisulfite¹⁰. La procédure comp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue de 1 mL	Terumo	SS+01T1	pour plaque NTA
24 puits	Corning	3524	MSC
culture cellulaire 3730xl Analyseur d’ADN	Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific	3730XL
50 mL Tube à centrifuger	Corning	430829
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifugeuse	Beckman
BlueStar Prestained Protein Marker	Nippon Genetics	MWP03	WB : marqueur protéique
Calnexin (clone C5C9)	Cell Signaling Technology	2679	WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6)	BD Biosciences	556019	WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 R	Eppendorf	5703000010	Pour milieux conditionnés et cellules
Centrifuge 5810	Eppendorf	5810000010	Pour la rotation d’une plaque à 96 puits
Tube à centrifuger (polyallomère, 14x95 mm)	Beckman	331374	Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium	Gibco, Life Technologies	31331-028	Pour la culture AT-MSC
Sérum fœtal bovin	Gibco, Life Technologies	10270-106
GeneScan 500 LIZ norme de taille	Applied Biosystems, Life Technologies	pour l’électrophorèse
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit	Sigma	WGA2-10RXN	pour contrôle négatif MSPA
Hi-Di formamide	Applied Biosystems, Life Technologies	4311320	pour l’électrophorèse capillaire
HOS-143B lignée cellulaire	ATCC	CRL-8303
Hsp70 (clone 5G10)	BD Biosciences	554243	WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Chèvre anti-souris	Li-Cor	926-32210	WB : secondaire
IRDye 800CW Chèvre anti-lapin	Li-Cor	926-32211	WB :
primaire LINE-1 sonde-mix	IDT		Séquences dans le tableau 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate avec code-barres	Applied Biosystems, Life Technologies	4306737	nécessite également un film d’étanchéité
Micro BCA Kit de dosage des protéines	ThermoFisher Scientific	23235	pour mesurer la concentration en protéines
MiniProtean TGX 10 % gels	Bio-Rad	456-1034	WB : électrophorèse sur gel
NanoSight LM14C	Malvern Instruments		pour membrane
nitrocellulosique NTA 0.2 µ ; m	Bio-Rad	1620112	WB : transfert de protéines
NucleoSpin Tissue XS	Macherey-Nagel	740901.50	pour l’extraction d’ADN
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	WB : bloquant, anticorps
PBS, 1X	Corning	21-040-CVR
Pénicilline-streptomycine	Gibco, Life Technologies	DE17-602E	Antibiotiques pour milieu de culture
Protein LoBind tube, 0,5 mL	Eppendorf	22431064	Pour le stockage Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit	Li-Cor	926-11015	WB : coloration des protéines totales
RKO lignée cellulaire	ATCC	CRL-2577	pour MSPA contrôle positif
RPMI medium 1640 + GlutaMAX	Gibco, Life Technologies	61870-010	Pour la culture cellulaire HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzyme	MRC-Holland	SMR50
SALSA MLPA kit de réactifs	MRC-Holland	EK1-FAM
SALSA MLPA P300 sonde-mix	MRC-Holland	P300-100R
Rotor oscillant SW-28	Beckman Coulter	342207	d’ultracentrifugation
, 0,22 & micro ; m	Jet Biofil	FPE-204-030	filtre stérile FBS
Tecnai 12	FEI Company		équipé de Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA) ; pour TEM
TBS, 1X comprimés	Medicago	09-7500-100	WB : tampon
Trans-Blot Turbo	Bio-Rad		WB : transfert
Thermocycleur	ThermoFisher Scientific
TrypLE Express	Gibco	12604-021	pour la trypsinisation des cellules
TSG101 (clone 4A10)	Sigma	SAB2702167	WB, dilution 1:500