कैंसर कोशिकाओं द्वारा प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल मध्यस्थता उन्मूलन की चोरी कैंसर दीक्षा और प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम हेपेटिक ट्यूमर कोशिकाओं की ओर एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकेशन का मूल्यांकन करने के लिए दो गैर-रेडियोधर्मिता-आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इसके अतिरिक्त, एनके सेल माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए एक तीसरा प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।
प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की साइटोटॉक्सिक लिम्फोसाइट आबादी का सबसेट हैं और रोगजनक-संक्रमित, घातक और तनावग्रस्त कोशिकाओं को साफ करके रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में भाग लेते हैं। कैंसर कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए एनके कोशिकाओं की क्षमता उन्हें कैंसर के खिलाफ लड़ाई में एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाती है। कई नए प्रतिरक्षा आधारित चिकित्सा कैंसर के इलाज के लिए जांच के अधीन है जो या तो एनके सेल गतिविधि को बढ़ाने या एनके सेल के लिए कैंसर की कोशिकाओं की संवेदनशीलता में वृद्धि पर भरोसा-मध्यस्थता उन्मूलन । हालांकि, इन चिकित्सीय दृष्टिकोणों को प्रभावी ढंग से विकसित करने के लिए, एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिबिलिटी और माइग्रेशन की निगरानी के लिए इन विट्रो परखों में लागत प्रभावी की भी जरूरत है । यहां, हम दो इन विट्रो प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो कैंसर कोशिकाओं (या अन्य लक्षित कोशिकाओं) पर एनके-सेल साइटोटॉक्सिकिटी के प्रभाव की मज़बूती और पुन: उत्पन्न कर सकते हैं। ये प्रोटोकॉल गैर-रेडियोधर्मिता आधारित हैं, स्थापित करने के लिए सरल हैं, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम एनके सेल माइग्रेशन की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल भी पेश करते हैं, जिसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। सामूहिक रूप से, इन तीन प्रोटोकॉल का उपयोग एनके सेल गतिविधि के प्रमुख पहलुओं की निगरानी के लिए किया जा सकता है जो बेकार लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त करने की कोशिकाओं की क्षमता के लिए आवश्यक हैं।
मानव शरीर की गैर-आत्म की पहचान करने और विदेशी वस्तुओं को समाप्त करने की क्षमता रोगजनकों और घातक1के खिलाफ मानव अस्तित्व की कुंजी है । मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है2,3,4. प्रमुख विशेषताओं और कार्यों के आधार पर, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को मोटे तौर पर दो प्रमुख कार्यात्मक समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली आमतौर पर किसी दिए गए रोगजनक के लिए विशिष्ट होती है और इसमें इम्यूनोलॉजिकल मेमोरी होती है और इस प्रकार, एक ही रोगजनक5,6,7,8,9द्वारा भविष्य के पुनः संक्रमण के लिए लंबे समय तक चलने वाली और उत्तरदायी होती है। इसके विपरीत, जन्मजात प्रतिरक्षा अपने लक्ष्य उन्मूलन और अपेक्षाकृत गैर विशिष्ट में बहुत व्यापक है । इसलिए, आमतौर पर, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इम्यूनोलॉजिकल रक्षा10की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करती है। प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली से संबंधित हैं और कुल परिसंचारी लिम्फोसाइट्स11का 10−15% प्रतिनिधित्व करती हैं। एनके कोशिकाएं दो प्रमुख तंत्रों के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त करती हैं। सबसे पहले, लिगांड को सक्रिय करने वाली कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी होने पर, एनके कोशिकाएं झिल्ली-बाधित प्रोटीन पर्फोनिन और सेरीन प्रोटीज़ ग्रैनज़ीम को एक्सोसाइटोसिस के माध्यम से छोड़ती हैं, जो संयुक्त रूप से लक्ष्य कोशिकाओं12,13,14,15में एपोप्टोसिस को प्रेरित करती हैं। इसके अतिरिक्त, एनके कोशिकाओं FasL और ट्यूमर परिगलन कारक से संबंधित एपोप्टोसिस-inducing ligand (ट्रेल) मौत रिसेप्टर्स (Fas/CD95) व्यक्त लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बातचीत, कैस्पा-निर्भर apoptosis16के लिए अग्रणी । सबसे महत्वपूर्ण बात, एनके कोशिकाओं को रोगजनक-संक्रमित या घातक कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए एंटीजन प्रस्तुति जैसे प्रीस्टिमुलेशन की आवश्यकता नहीं होती है; इस प्रकार, वे आमतौर पर एक तैयार करने के लिए मार राज्य17,18में हैं . आदेश में ट्यूमर के विकास और प्रगति को बाधित करने और कैंसर की कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए, एनके कोशिकाओं ट्यूमर साइट के लिए माइग्रेट करना चाहिए और, एक बार ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में, पहचान और लक्ष्य कोशिकाओं पर हमला ।
अतीत में, एनके-सेल प्रभावक कार्यों की मुख्य रूप से निगरानी की गई थी, जिसमें19,20,21को डिग्रेनुलेशन और साइटोटॉक्सिकिटी परख दिया गया था। एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी को 51क्रोमियम रिलीज परख22,23,24,25से भी मापा जा सकता है . हालांकि, इस परख में कुछ विशिष्ट आवश्यकताएं हैं, जिनमें गामा काउंटर की आवश्यकता शामिल है, और रेडियोधर्मिता आधारित है, जिसके लिए रेडियोधर्मी सामग्रियों से निपटने और निपटान में प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और उपयोगकर्ता के लिए जोखिम का स्तर बन जाता है। इसलिए, एनके सेल गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कई नए गैर-रेडियोधर्मिता आधारित परखों को विकसित और नियोजित किया गया है ।
यहां, हम एनके सेल-मध्यस्थकैंसर सेल उन्मूलन को मापने के लिए दो ऐसे प्रोटोकॉल, रंगीमेट्रिक लैक्टिक डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) माप-आधारित एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिक परख और कैल्सिन एसिटॉक्सीमिथाइल (एएम) धुंधला आधारित सूक्ष्म विधि का वर्णन करते हैं। इन परखों को रेडियोआइसोटोप के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, सीधी, संवेदनशील होती हैं, और एनके सेल फ़ंक्शन को मिलाने वाले कारकों की पहचान करती हैं। इसके अतिरिक्त, क्योंकि एनके सेल माइग्रेशन में परिवर्तनों की निगरानी के बिना एनके सेल फ़ंक्शन का पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है, हम एनके सेल माइग्रेशन की निगरानी के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्रात्मक विधि भी पेश करते हैं।
यहां वर्णित साइटोटॉक्सिकिटी और माइग्रेशन विधियों का उपयोग कैंसर कोशिकाओं और एनके सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा चोरी तंत्र को घातक ट्यूमर में एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन करने के साथ-साथ चिकित्सकीय एजेंटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एनके सेल गतिविधि/कार्य को बढ़ाएंगे । प्रोटोकॉल शास्त्रीय रेडियोधर्मिता आधारित 51क्रोमियम रिलीज परख के लिए सरल, संवेदनशील, प्रजनन योग्य और बेहतर विकल्प हैं। प्रोटोकॉल को विशेष रूप से अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलनीय होने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें सीधा रंग-रोगन, सूक्ष्म, या एफएसीएस आधारित रीडआउट हैं जो व्याख्या करना आसान है, जिससे शोधकर्ताओं को विश्वसनीय निष्कर्षतक पहुंचने की अनुमति मिल सके। सभी उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग-आधारित दृष्टिकोणों के लिए स्केलेबल हैं। हालांकि प्रोटोकॉल एक ही hepatic ट्यूमर सेल लाइन के संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे हैं, वे आसानी से अंय कैंसर सेल प्रकार और/
जबकि प्रस्तुत किए गए सभी तरीके मजबूत और प्रजनन योग्य हैं, अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता कैंसर कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के विभिन्न बैचों के साथ हो सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम प्रयोगों के निष्कर्षों का सही समर्थन करते हैं, जैविक ट्रिपलिकेट्स का उपयोग करके प्रयोग को कम से कम दो बार दोहराने की सलाह दी जाती है।
इस विधि की एक सीमा यह है कि NK92MI कोशिकाओं की वृद्धि दर धीमी हो सकती है। इसलिए, ५० या अधिक नमूनों के साथ प्रयोगों के लिए, विलंब को रोकने के लिए NK92MI की पर्याप्त संख्या पहले से उगाई जानी चाहिए । इसके अलावा, प्रोटोकॉल में वर्णित सभी नियंत्रणों को नकली और गैर-उत्पादक परिणामों से बचने के लिए लागू किया जाना चाहिए । एनके साइटोटॉक्सिकिटी परख की एक और सीमा यह है कि एनके टू कैंसर सेल अनुपात, साथ ही ऊष्मायन समय, प्रत्येक लक्ष्य कोशिका के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, हमने कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न अनुपातों का परीक्षण एनके कोशिकाओं (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 और 1:80) हेपेटिक कैंसर सेल लाइनों के लिए किया है, साथ ही कई ऊष्मायन समय (2, 3, 4, 5, और 6 एच)। हमारे परिणामों के आधार पर हम एनके कोशिकाओं और 3 एच के लिए ऊष्मायन के लिए कैंसर कोशिकाओं के 1:10 और 1:20 अनुपात के साथ सबसे सुसंगत परिणाम मनाया ।
इसके अलावा, ठोस ट्यूमर से प्राप्त कैंसर कोशिकाओं को देते है और संस्कृति की थाली की सतह पर विकसित होगा, जबकि एनके कोशिकाओं के निलंबन में वृद्धि होती है । यदि ऊष्मायन समय 3 घंटे से अधिक लंबा है, तो अल्ट्रालो अटैचमेंट 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जिससे प्रयोगों और जैविक प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता और प्रजनन क्षमता में सुधार होगा। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनके सेल-प्रेरित साइटोटॉक्सिकिलिटी परख भी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) से अलग प्राथमिक एनके कोशिकाओं का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के प्रयोगों के साथ कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, इन प्रयोगों के रूप में आसानी से NK92MI कोशिकाओं के साथ के रूप में नहीं पहुंचा जा सकता है । दूसरा, पीएमबीसी से अलग एनके कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक गतिविधि का बैच-टू-बैच भिन्नता परिणामों की प्रजनन क्षमता और व्याख्या के मामले में समस्याग्रस्त हो सकती है । इसी तरह, साहित्य में अन्य मानव एनके सेल लाइनों का वर्णन किया गया है और इस प्रकार के प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एनकेएल कोशिकाएं शामिल हैं29; हालांकि, एनके-92एमआई कोशिकाओं के विपरीत, एनकेएल कोशिकाएं आईएल-2 निर्भर हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।
कैल्सीन एएम के प्रयोगों पर विचार करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कैल्सिन एएम सेल डेथ30के बाद अपोप्टोटिक शरीर में रहता है। इसलिए, कैल्सिन एएम धुंधला की मात्रा को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए, क्योंकि इससे एनके साइटोटॉक्सिकिटी का कम अनुमान लग सकता है।
एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी के समान, साइटोकिन्स और अन्य कीमोआकर्षितेंट द्वारा एनके सेल माइग्रेशन का मॉड्यूलेशन एनके सेल फ़ंक्शन के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एनके सेल माइग्रेशन परख यहां वर्णित एक सरल मंच प्रदान करता है जैसे कि केमोकिन या कीमोआकर्षितेंट जैसे उत्तेजना के संदर्भ में एनके सेल माइग्रेशन का मूल्यांकन किया जाता है। इस परख का उपयोग उन एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है जो एनके सेल माइग्रेशन को बढ़ावा दे सकते हैं या हस्तक्षेप कर सकते हैं – इस प्रकार, एनके सेल माइग्रेशन के एन्हांसर्स और दमनकों की पहचान करना। यह विधि आनुवंशिक/एपीजेनेटिक परिवर्तन (अपरेगुलेशन या डाउनरेगुलेशन) या दवा उपचार के कारण उत्पन्न होने के परिणामस्वरूप एनके सेल माइग्रेशन नियामक क्षमता का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी हो सकती है ।
एनके सेल माइग्रेशन को सही ढंग से मापने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका पालन किया जाना चाहिए। वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर प्रयोगों के सभी के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि समकक्ष वातानुकूलित माध्यम दोनों नियंत्रण और उपचार की स्थिति से इस्तेमाल किया जा करने के लिए सटीक माप प्राप्त है । ऊष्मायन का समय शुद्ध रसायनार्थियों और वातानुकूलित माध्यम के साथ भिन्न होगा। अंत में, ट्रांसवेल माइग्रेशन परख अच्छी तरह से स्थापित किए जाते हैं और एनके सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि माना जाता है; हालांकि, परखों में नियोजित सजातीय मोनोकल्चर में ऊतकों या यहां तक कि 3 डी संस्कृतियों के जटिल शरीर विज्ञान की कमी होती है जो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की अधिक सटीक नकल कर सकती हैं।
इस प्रकार, हालांकि एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी परख और एनके माइग्रेशन परख के लिए कुछ सीमाएं हैं जो इस लेख में प्रस्तुत की गई हैं, ये परख प्रतिरक्षा अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं और इस प्रकार एनके सेल का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण और विश्वसनीय तरीके प्रदान करते हैं समारोह और एनके सेल मॉड्यूलरी प्रतिरक्षा चिकित्सा।
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञता से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान स्वीकार करते हैं: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW), और 1R01 CA218008-01A1 (NW) । हम भी रक्षा वित्तपोषण के विभाग W81XWH1910480 और W81XWH-18-1-0069 एनडब्ल्यू को स्वीकार करते हैं ।
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |