Unndragelse av naturlig morder (NK) cellemediert utryddelse av kreftceller er viktig for kreftinitiering og progresjon. Her presenterer vi to ikke-radioaktivitetsbaserte protokoller for å evaluere NK cellemediert cytotoksisitet mot levertumorceller. I tillegg presenteres en tredje protokoll for å analysere NK-celleoverføring.
Naturlige killer (NK) celler er en undergruppe av cytotoksiske lymfocyttpopulasjonen i det medfødte immunsystemet og delta som en første forsvarslinje ved å rydde patogen-infiserte, ondartede og stressede celler. Evnen til NK-celler til å utrydde kreftceller gjør dem til et viktig verktøy i kampen mot kreft. Flere nye immunbaserte behandlinger er under etterforskning for kreftbehandling som er avhengige av å forbedre NK celleaktivitet eller øke følsomheten til kreftceller til NK cellemediert utryddelse. Men for å effektivt utvikle disse terapeutiske tilnærmingene, er det også nødvendig med kostnadseffektive in vitro-analyser for å overvåke NK cellemediert cytotoksisitet og migrasjon. Her presenterer vi to in vitro-protokoller som pålitelig og reproduserereffekten av NK-cellecytotoksisitet på kreftceller (eller andre målceller). Disse protokollene er ikke-radioaktivitetsbaserte, enkle å sette opp, og kan skaleres opp for screening med høy gjennomstrømning. Vi presenterer også en flow cytometribasert protokoll for å kvantitativt overvåke NK cellemigrasjon, som også kan skaleres opp for høy gjennomstrømning screening. Samlet kan disse tre protokollene brukes til å overvåke viktige aspekter ved NK-celleaktivitet som er nødvendige for cellenes evne til å utrydde dysfunksjonelle målceller.
Menneskekroppens evne til å identifisere ikke-selv og utrydde fremmedlegemer er nøkkelen til menneskelig overlevelse mot patogener og maligniteter1. Den menneskelige immunresponsen spiller den viktigste rollen i denne prosessen2,3,4. Basert på viktige egenskaper og funksjoner, kan det menneskelige immunsystemet være bredt klassifisert i to store funksjonelle grupper: det adaptive immunforsvaret og det medfødte immunsystemet. Det adaptive immunforsvaret er vanligvis spesifikt for et gitt patogen og har immunologisk minne og dermed er langvarig og responsiv til fremtidig reinfeksjon av samme patogen5,6,7,8,9. I motsetning er medfødt immunitet mye bredere i sin målutryddelse og relativt uspesifikk. Derfor tjener den medfødte immunresponsen som den første linjen av immunologisk forsvar10. Naturlige killer (NK) celler tilhører det medfødte immunsystemet og representerer 10-15% av totalt sirkulerende lymfocytter11. NK-celler utrydder målceller via to hovedmekanismer. Først, ved binding til målceller som uttrykker aktivering av ligander, slipper NK-celler det membranforstyrrende proteinet perforin og serinprotease granzymer gjennom exocytose, som i fellesskap induserer apoptose i målceller12,13,14,15. I tillegg, NK celler som uttrykker FasL og tumor nekrose faktor-relaterte apoptose-inducing ligand (TRAIL) samhandle med målceller som uttrykker dødreseptorer (Fas / CD95), fører til caspase-avhengig apoptose16. Viktigst av alt, NK-celler krever ikke prestimulering, for eksempel antigenpresentasjon, for å utrydde patogene infiserte eller ondartede celler; dermed er de vanligvis i en klar til å drepe tilstand17,18. For å hemme tumorutvikling og progresjon og utrydde kreftceller, må NK-celler migrere til tumorstedet og, en gang i tumormikromiljøet, identifisere og angripe målcellene.
Tidligere ble NK-celleeffektorfunksjoner hovedsakelig overvåket av degranulering og cytotoksisitetsanalyser19,20,21. NK celle cytotoksisitet kan også måles med 51krom utgivelsen analyse22,23,24,25. Denne analysen har imidlertid noen spesifikke krav, inkludert behovet for en gammateller, og er radioaktivitetsbasert, noe som krever opplæring i håndtering og avhending av radioaktive materialer og utgjør et risikonivå for brukeren. Derfor er flere nye ikke-radioaktivitetsbaserte analyser utviklet og ansatt for å studere NK-celleaktivitet.
Her beskriver vi to slike protokoller, koloimetrisk laktisk dehydrogenase (LDH) målebasert NK cellemediert cytotoksisitetanalyse og kalsinacetoktyl (AM) fargingsbasert mikroskopisk metode for å måle NK cellemediert kreftcelleutryddelse. Disse analysene krever ikke bruk av radioisotoper, er enkle, følsomme og reproduserbare identifisere faktorer som modulerer NK cellefunksjon. I tillegg, fordi NK-cellefunksjonen ikke kan evalueres fullt ut uten å overvåke endringer i NK-cellemigrasjon, presenterer vi også en flytcytometribasert kvantitativ metode for å overvåke NK-cellemigrasjon.
Cytotoksisitets- og migrasjonsmetodene som er beskrevet her, kan brukes til å evaluere NK-cellecytotoksisitet til kreftceller og NK cellemedierte immununndragelsesmekanismer i ondartede svulster, samt å identifisere terapeutiske midler som vil forbedre NK celleaktivitet/funksjon. Protokollene er enkle, følsomme, reproduserbare og fortrinnsvis alternativer til klassisk radioaktivitetsbasert 51kromutgivelsesanalyse. Protokollene er spesielt utformet for å være lett tilpasningsdyktige for bruk i de fleste laboratorier, med enkle kolormetriske, mikroskopiske eller FACS-baserte avlesninger som er enkle å tolke, slik at forskere kan nå pålitelige konklusjoner. Alle er skalerbare for screeningbaserte tilnærminger med høy gjennomstrømning. Selv om protokollene presenteres i sammenheng med en enkelt hepatisk tumorcellelinje, kan de enkelt tilpasses lett til andre kreftcelletyper og/eller andre ikke-kreftmålceller.
Mens alle metodene som presenteres er robuste og reproduserbare, kan intereksperimentell variasjon oppstå med forskjellige grupper av kreftceller og NK-celler. For å sikre at resultatene nøyaktig støtter konklusjonene i forsøkene, er det tilrådelig å gjenta eksperimentet minst to ganger ved hjelp av biologiske triplisetter.
En begrensning av denne metoden er at veksten av NK92MI-celler kan være treg. Derfor, for eksperimenter med 50 eller flere prøver, bør tilstrekkelig antall NK92MI dyrkes på forhånd for å forhindre forsinkelser. Også alle kontrollene som er beskrevet i protokollene må implementeres for å unngå falske og ikke-reproduserbare resultater. En annen begrensning av NK cytotoksisitetanalyse er at NK til kreftcelleforholdet, samt inkubasjonstiden, må optimaliseres for hver målcelle. For eksempel har vi testet ulike forhold mellom kreftceller og NK-celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 og 1:80) for hepatiske kreftcellelinjer, samt flere inkubasjonstider (2, 3, 4, 5 og 6 timer). Basert på våre resultater observerte vi mest konsistente resultater med 1:10 og 1:20 prosentav kreftceller til NK-celler og inkubasjon i 3 timer.
I tillegg vil kreftceller avledet fra faste svulster feste og vokse på overflaten av kulturplaten, mens NK-celler vokser i suspensjon. Hvis inkubasjonstiden er lengre enn 3 timer, anbefales det å bruke ultralave vedlegg 96 brønnplater, noe som vil forbedre konsistensen og reproduserbarheten mellom eksperimenter og biologiske replikater. Det er også viktig å merke seg at NK celleindusert cytotoksisitet si kan også utføres ved hjelp av primære NK-celler isolert fra perifere blod mononukleære celler (PBMCs). Det er imidlertid flere begrensninger med slike eksperimenter. For det første kan disse eksperimentene ikke skaleres like enkelt som med NK92MI-celler. For det andre kan batch-til-batch-variasjon av cytotoksisk aktivitet av NK-celler isolert fra PMBCer være problematisk når det gjelder reproduserbarhet og tolkning av resultatene. På samme måte er andre menneskelige NK-cellelinjer beskrevet i litteraturen og kan brukes i disse typer eksperimenter, inkludert NKL-celler29; I motsetning til NK-92MI-celler er Imidlertid NKL-celler IL-2 avhengige og ikke kommersielt tilgjengelige.
Når du vurderer calcein AM eksperimenter beskrevet, er det viktig å merke seg at calcein AM forblir i apoptotiske organer etter celledød30. Derfor bør mengden av calcein AM farging utføres nøye, da det kan føre til en undervurdering av NK cytotoksisitet.
I likhet med NK cellemediert cytotoksisitet spiller modulasjon av NK-cellemigrasjon av cytokiner og andre kjemoattractanter en viktig rolle i reguleringen av NK-cellefunksjonen. NK celle migrasjon analyse beskrevet her gir en enkel plattform for å evaluere NK celle migrasjon i sammenheng med en stimulans som en chemokine eller kjemoattractant. Denne analysen kan brukes til å evaluere agenter som enten kan fremme eller forstyrre NK-cellemigrasjon – og dermed identifisere enhancers og repressors av NK cellemigrasjon. Denne metoden kan også være nyttig å studere NK celle migrasjon regulatoriske kapasitet som følge av en genetisk / epigenetiske endringer (upregulation eller downregulation) eller oppstår på grunn av narkotikabehandling.
For å måle NK-cellemigrasjonen nøyaktig, er det få kritiske trinn som bør følges. For alle forsøkene ved hjelp av betinget medium er det viktig at tilsvarende betinget medium brukes fra både kontroll- og behandlingsforhold for å oppnå nøyaktige målinger. Inkubasjonstiden vil bli variert med rensede kjemoattractanter og betinget medium. Til slutt er transwell migrasjon analyser godt etablert og betraktet som en utmerket metode for å vurdere NK celle migrasjon; Imidlertid mangler de homogene monokulturene som brukes i analyser den komplekse fysiologien til vev eller til og med 3D-kulturer som mer nøyaktig kan etterligne tumormikromiljøet.
Dermed, selv om det er noen begrensninger for NK-cellecytotoksisitetsanalysene og NK-migrasjonsanalysen som presenteres i denne artikkelen, gjelder disse analysene for et bredt spekter av immunologiske studier og gir dermed viktige og pålitelige metoder for å vurdere NK-celle og NK celle modulatoriske immunterapier.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner takknemlig tilskudd fra National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) og 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi anerkjenner også Forsvarsdepartementets finansiering W81XWH1910480 og W81XWH-18-1-0069 til NW.
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |