JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Обогащение тканей млекопитающих и ксенопусов с холестерином

Published: March 25, 2020
doi:
10.3791/60734
, , , , ,
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology,The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Chicago

Summary

Представлены два метода обогащения холестерина: применение циклодекстрин насыщенного холестерином для обогащения тканей и клеток млекопитающих, а также использование обогащенных холестерином фосфолипидных дисперсий (липосом) для обогащения клеточных яйцеклеток. Эти методы являются полезными для определения влияния повышенного уровня холестерина в молекулярной, клеточной и органной функции.

Abstract

Холестерин обогащения тканей млекопитающих и клеток, в том числе Ксенопус ооцитов, используемых для изучения функции клеток, может быть достигнуто с помощью различных методов. Здесь мы описываем два важных подхода, используемых для этой цели. Во-первых, мы описываем, как обогащать ткани и клетки с помощью циклодекстрин насыщен холестерина с помощью мозговых артерий (тканей) и гиппокампа нейронов (клеток) в качестве примеров. Этот подход может быть использован для любого типа тканей, клеток или клеточных линий. Альтернативный подход к обогащению холестерина предполагает использование липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Преимущество этого подхода является то, что он использует часть естественного холестерина гомеостаза машины клетки. Однако, в то время как циклодекстрин подход может быть применен для обогащения любого типа клеток с холестерином, LDL подход ограничивается клетками, которые выражают ldL рецепторов (например, клетки печени, костного мозга полученных клеток, таких как лейкоциты крови и ткани макрофагов), и уровень обогащения зависит от концентрации и мобильности рецептора ЛПНП. Кроме того, частицы ЛПНП включают в себя другие липиды, поэтому доставка холестерина неспецифическая. Во-вторых, мы описываем, как обогатить ооциты ксенопуса холестерином с помощью дисперсии на основе фосфолипидов (т.е. липосом), которая включает холестерин. Ксенопусские яйцеклетки представляют собой популярную гетерологусную систему экспрессии, используемую для изучения функции клеток и белков. Как для циклодекстрин основе холестерина обогащения подход млекопитающих тканей (мозговых артерий) и фосфолипид основе холестерина обогащения подход ксенопуса ооцитов, мы пяндекс. Этот уровень холестерина остается неизменным в течение длительных периодов инкубации (например, 60 мин). В совокупности эти данные обеспечивают основу для оптимизированных временных условий для обогащения холестерина тканей, клеток и ооцитов ксенопусов для функциональных исследований, направленных на изучение влияния обогащения холестерина.

Introduction

Холестерин, основной клеточный липид, играет многочисленные критические функциональные и структурные роли1,,2,,3,,4,,55,66,7,8,,9. От регулирования физических свойств плазменной мембраны до обеспечения жизнеспособности клеток, роста, пролиферации и использования молекулы сигнала и прекурсора в изобилии биохимических путей, холестерин является императивным компонентом, необходимым для нормальной функции клеток и органов. В результате дефицит холестерина приводит к тяжелым физическим порокам развития и различным расстройствам. С другой стороны, даже небольшое повышение уровня холестерина выше физиологических уровней (2-3x),является цитотоксическим1,,2,,10 и было связано с развитием нарушений, в том числе сердечно-сосудистых11,,12,,13 и нейродегенеративных заболеваний14,15,16,17. Таким образом, для изучения важнейших функций холестерина и определения влияния изменений уровня холестерина были разработаны различные подходы, которые изменяют содержание холестерина в тканях, клетках и ксенопух.

Изменение уровня холестерина в тканях и клетках млекопитающих
Несколько подходов могут быть использованы для снижения уровня холестерина в тканях и клетках18. Один подход включает в себя их воздействие статинов, растворенных в липопротеино-дефицитной сыворотке для ингибирования HMG-CoA редуктазы, которая контролирует скорость синтеза холестерина19,20. Тем не менее, эти препараты снижения уровня холестерина также препятствуют образованию нестероловых продуктов вдоль мевалонатного пути. Таким образом, небольшое количество мевалоната добавляется, чтобы позволить образование этих продуктов21 и повысить специфику этого подхода. Другой подход к снижению уровня холестерина включает в себя использование циклодекстрин. Эти гюфрироранозы мономеры обладают внутренней гидрофобной полости с диаметром, который соответствует размеру стеринов22, что облегчает извлечение холестерина из клеток, тем самым истощая их от родного содержания холестерина23. Примером является 2-гидроксипропил-я-циклодекстрин (HP-CD), доклинический препарат в настоящее время тестируется для лечения ниманн-Пик типа C болезни, генетически наследственных смертельных метаболических расстройств, характеризующихся лизосомального холестерина хранения24. Уровень истощения холестерина зависит от конкретной производной используется. Например, HP-CD извлекает холестерин с меньшей емкостью, чем метилированные производные, метил-и-циклодекстрин (МЗКД)24,25,26,27,28,29,30. Примечательно, однако, что циклодекстрины могут также извлекать другие гидрофобные молекулы в дополнение к холестерину, что может привести к неспецифическим эффектам31. В отличие от истощения, клетки и ткани могут быть специально обогащены холестерином путем лечения циклодекстрином, который был донасыщен холестерином23. Этот подход также может быть использован в качестве контроля для специфики q-циклодекстринов, используемых для истощения холестерина31. Истощение холестерина из тканей и клеток является простым и может быть достигнуто путем разоблачения клеток в течение 30-60 мин до 5 мМ ММ МЗКД растворяется в среде, используемой для хранения клеток. Такой подход может привести к 50% снижению содержания холестерина (например, в гиппокампе нейронов32, крысиных мозговых артерий33). С другой стороны, подготовка комплекса к циклодекстрин-холестерин для обогащения холестерина тканей и клеток является более сложной и будет описана в разделе протокола.

Альтернативный подход к обогащению тканей и клеток с использованием циклодекстрин насыщен холестерина включает в себя использование ЛПНП, который опирается на рецепторы ЛПНП, выраженные в тканях / клетках18. Хотя этот подход предлагает преимущество использования природного холестерина гомеостаза машины клетки, он имеет несколько ограничений. Во-первых, ткани и клетки, которые не выражают рецептор ЛПНП не могут быть обогащены с помощью этого подхода. Во-вторых, частицы ЛПНП содержат другие липиды в дополнение к холестерину. В частности, ЛПНП состоит из белка ApoB100 (25%) и следующие липиды (75%): 6-8% холестерина, 45-50% холестериновый эфир, 18-24% фосфолипидов и 4-8% триацилглицерола34. Таким образом, доставка холестерина через частицы ЛПНП является неспецифической. В-третьих, процент увеличения содержания холестерина ЛПНП в тканях и клетках, которые выражают рецептор ЛПНП может быть значительно ниже, чем увеличение наблюдается с помощью циклодекстрин насыщенхолестерина холестерина. Например, в предыдущем исследовании, обогащение грызунов мозговых артерий с холестерином через ЛПНП привело только 10-15% увеличение уровня холестерина35. В отличие от этого, обогащение этих артерий циклодекстрином, насыщенным холестерином, как описано в разделе протокола, привело к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел «Результаты представительства», рисунок 1).

Изменение уровня холестерина в яйцеклетках Ксенопуса
Ксенопусские яйцеклетки представляют собой гетерологовую систему экспрессии, обычно используемую для изучения функции клеток и белков. Более ранние исследования показали, что соотношение холестерина к фосфолипидным молярным соотношению у ооцитов Ксенопуса составляет 0,5 и 0,136. Из-за этого внутренне высокий уровень холестерина, повышение содержания холестерина в этой системе является сложной задачей, но может быть достигнуто с помощью дисперсии из мембранных фосфолипидов и холестерина. Фосфолипиды, которые мы выбрали для этой цели, аналогичны тем, которые используются для формирования искусственных планарных липидных бислой и включают L-я-фосфатидидаланоламин (POPE) и 1-palmitoyl-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфо-л-серин (POPS), как описано в разделе протокола. Такой подход может привести к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел “Результаты представлений”, рисунок 2).

Альтернативный подход к обогащению ооцитов ксенопуса фосфолипидными дисперсиями предполагает использование циклодекстрин, насыщенный холестерином, который похож на то, как обогащаются ткани и клетки. Тем не менее, мы обнаружили, что этот подход имеет низкую воспроизводимость и эффективность, в среднем на 25% больше содержания холестерина. Это, возможно, связано с различной грузоподъемностью этих двух подходов (см. раздел “Результаты представитель”, рисунок 3). В отличие от этого, было показано, что использование циклодекстрин для истощения холестерина из ооцитов Ксенопуса может привести к снижениюсодержанияхолестерина на 40%.

Здесь мы сосредоточиваемся на обогащении холестерина тканей и клеток млекопитающих путем применения циклодекстрин насыщенных холестерином, и ксенопусов ооцитов с использованием липосом. Оба подхода могут быть использованы для разграничения влияния повышенного уровня холестерина на функцию белка. Механизмы модуляции холестерина функции белка могут включать прямые взаимодействия8 и/или косвенные эффекты9. Когда холестерин влияет на функцию белка через прямые взаимодействия, влияние повышения уровня холестерина на активность белка, вероятно, не зависит от типа клеток, системы выражения или подхода обогащения. Например, мы использовали эти два подхода, чтобы определить влияние холестерина на G-белок закрытых внутренне выправляя калия (GIRK) каналов, выраженных в предсердий миоцитов37, гиппокампа нейронов32,38, HEK29339 клеток, и Ксенопус ооцитов32,37. Результаты, полученные в этих исследованиях, были последовательными: во всех трех типах клеток млекопитающих и в оицитах амфибий холестерина upregulated GIRK функции канала (см. Представитель Результаты раздела, Рисунок 4, для гиппокампа нейронов и соответствующие эксперименты в ооцитов Ксенопуса). Кроме того, наблюдения, сделанные в этих исследованиях, также согласуются с результатами исследований, проведенных в предсердий миоцитов37,40 и гиппокампа нейронов32,38 свежеизолированных от животных, подвергаемых высоким уровнем холестерина диеты40. Примечательно, что обогащение холестерина гиппокампа нейронов с помощью МЗКД обратить вспять эффект аторвастатина терапии, используемой для решения воздействия диеты с высоким уровнем холестерина как на уровень холестерина и GIRK функции38. В других исследованиях мы исследовали влияние мутаций на чувствительность холестерина внутренне выправляющего калийный канал Kir2.1 с использованием обоих клеток Xenopus и клеток HEK29341. Опять же, влияние мутаций на чувствительность канала было аналогичным в двух системах.

Применение обоих методов обогащения для определения влияния повышенного уровня холестерина на молекулярную, клеточную и органную функцию многочисленны. В частности, использование циклодекстрин-холестериновых комплексов для обогащения клеток и тканей очень распространено во многом благодаря своей специфичности. Недавние примеры такого подхода включают определение влияния холестерина на активацию канала HERG и основные механизмы42, открытие, что холестерин активирует G белка связаны рецептор Smoothened содействовать Ежик сигнализации43, и определение роли холестерина в биомеханики стволовых клеток и адипогенеза через мембраны связанных связующих белков44. В нашей собственной работе, мы использовали обогащение тканей млекопитающих с комплексом M’CD: холестерин для изучения влияния обогащения холестерина на основную функцию и фармакологический профиль кальция- и напряжения-gated каналов большой проводимости (BK, MaxiK) в сосудистой гладкой мышце35,45,46. В других исследованиях, мы использовали фосфолипид основе дисперсии подход для обогащения ксенопусов ооцитов с холестерином, чтобы определить роли различных регионов в Kir2.1 и GIRK каналов в холестериновой чувствительности41,47,48,49, а также для определения предполагаемых холестеринсвязных сайтов в этих каналах32,50,51.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с животными были проведены в Научном центре здоровья Университета Теннесси (UTHSC). Уход за животными и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию UTHSC, который является учреждением, аккредитова…

Representative Results

Использование циклодекстрин насыщен холестерина в качестве средства для обогащения тканей и клеток с холестерином хорошо установлено. Здесь мы сначала демонстрируем применение этого широко используемого подхода для обогащения крысиных мозговых артерий холестерин…

Discussion

Методы обогащения тканей и клеток млекопитающих и ксенопусов холестерином представляют собой мощный инструмент для исследования влияния повышенного уровня холестерина на отдельные молекулярные виды, на сложные макромолекулярные системы (например, белки) и на клеточные и органн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Грант развития ученых (11SDG5190025) от Американской ассоциации сердца (в A.R.-D.), и Национальный институт здравоохранения R01 грантов AA-023764 (до A.N.B.), и HL-104631 и R37 AA-11560 (к A.M.D.).

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1135 (2019).
  9. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration?. Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer’s disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage?. Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A., Kumar, S. A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. , 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Tags

Keywords: Cholesterol EnrichmentXenopus OocytesHypercholesterolemiaCellular MembranesCerebral ArteriesCircle Of WillisMethyl-beta-cyclodextrinCholesterol Saturated SolutionLipid HandlingFilipin Staining
check_url/60734?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image