Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol
Summary
Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.
Abstract
O enriquecimento de colesterol de tecidos e células de mamíferos, incluindo os oócitos xenopus usados para estudar a função celular, pode ser realizado usando uma variedade de métodos. Aqui, descrevemos duas abordagens importantes usadas para este fim. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando ciclodextrina saturada com colesterol usando artérias cerebrais (tecidos) e neurônios hipocampais (células) como exemplos. Esta abordagem pode ser usada para qualquer tipo de tecido, células ou linhas celulares. Uma abordagem alternativa para o enriquecimento do colesterol envolve o uso de lipoproteína de baixa densidade (LDL). A vantagem dessa abordagem é que ela usa parte do maquinário de homeostase natural da célula. No entanto, considerando que a abordagem da ciclodextrina pode ser aplicada para enriquecer qualquer tipo de interesse celular com colesterol, a abordagem lDL é limitada a células que expressam receptores LDL (por exemplo, células hepáticas, células derivadas da medula óssea, como leucócitos sanguíneos e macrófagos teciduais), e o nível de enriquecimento depende da concentração e da mobilidade do receptor LDL. Além disso, as partículas de LDL incluem outros lipídios, por isso a entrega de colesterol não é específica. Em segundo lugar, descrevemos como enriquecer os oócitos de Xenopus com colesterol usando uma dispersão à base de fosfolipídeos (ou seja, liposóficos) que inclui colesterol. Os oócitos xenopus constituem um popular sistema de expressão heteróloga usado para estudar a função celular e proteica. Tanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de ciclodextrina do tecido mamífero (artérias cerebrais) quanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de fosfolipídeos de oócitos xenopus, demonstramos que os níveis de colesterol atingem um máximo após 5 min de incubação. Esse nível de colesterol permanece constante durante longos períodos de incubação (por exemplo, 60 min). Juntos, esses dados fornecem a base para condições temporais otimizadas para o enriquecimento de colesterol de tecidos, células e oócitos de Xenopus para estudos funcionais que visam interrogar o impacto do enriquecimento do colesterol.
Introduction
O colesterol, um dos principais lipídios celulares, desempenha numerosos papéis funcionais e estruturais críticos1,,2,,3,4,5,,66,7,,8,9. Desde a regulação das propriedades físicas da membrana plasmática até a garantia da viabilidade celular, crescimento, proliferação e servindo como uma molécula de sinalização e precursora em uma infinidade de vias bioquímicas, o colesterol é um componente imperativo necessário para a função normal de células e órgãos. Como resultado, a deficiência de colesterol resulta em malformações físicas graves e uma variedade de distúrbios. Por outro lado, mesmo um pequeno aumento do colesterol acima dos níveis fisiológicos (2-3x) é citotóxico1,2,10 e tem sido associado ao desenvolvimento de distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares11,,12,,13 e neurodegenerativas14,,15,16,17. Assim, para interrogar as funções críticas do colesterol e determinar o efeito das mudanças nos níveis de colesterol, foram desenvolvidas diferentes abordagens que alteram o conteúdo do colesterol em tecidos, células e oócitos xenopus.
Alteração dos níveis de colesterol em tecidos e células de mamíferos
Várias abordagens podem ser aproveitadas para diminuir os níveis de colesterol nos tecidos e células18. Uma abordagem envolve sua exposição a estatinas dissolvidas no soro lipoproteína-deficiente para inibir a redução do HMG-CoA, que controla a taxa de síntese de colesterol19,20. No entanto, essas drogas que reduzem o colesterol também inibem a formação de produtos não-esterol ao longo do caminho mevalonato. Portanto, uma pequena quantidade de mevalonato é adicionada para permitir a formação desses produtos21 e aumentar a especificidade dessa abordagem. Outra abordagem para a diminuição dos níveis de colesterol envolve o uso de β-ciclodextrinas. Estes monômeros glucopyranose possuem uma cavidade hidrofóbica interna com diâmetro que corresponde ao tamanho dos esteróis22, o que facilita a extração de colesterol das células, esgotando-os de seu teor de colesterol nativo23. Um exemplo é a 2-hidroxipropipil-β-ciclodextrina (HPβCD), uma droga pré-clínica atualmente sendo testada para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C, uma desordem metabólica fatal geneticamente herdada caracterizada pelo armazenamento de colesterol lysossomal24. O nível de esgotamento do colesterol depende do derivado específico utilizado. Por exemplo, o HPβCD extrai colesterol com uma capacidade menor do que o derivado metilado, metil-β-ciclodextrina (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Notavelmente, no entanto, β-ciclodextrinas também podem extrair outras moléculas hidrofóbicas além do colesterol, o que pode resultar em efeitos inespecíficos31. Em contraste com o esgotamento, as células e tecidos podem ser especificamente enriquecidos com colesterol através do tratamento com β-ciclodextrina que foi pré-saturada com colesterol23. Esta abordagem também pode ser usada como um controle para a especificidade das β-ciclodextrinas utilizadas para o esgotamento do colesterol31. O esgotamento do colesterol de tecidos e células é simples e pode ser alcançado expondo as células de 30-60 min a 5 mM MβCD dissolvido no meio usado para armazenar as células. Essa abordagem pode resultar em uma redução de 50% no teor de colesterol (por exemplo, em neurônios hipocampais32, artérias cerebrais de ratos33). Por outro lado, preparar o complexo β-ciclodextrina-colesterol para o enriquecimento de colesterol de tecidos e células é mais complexo, e será descrito na seção de protocolo.
Uma abordagem alternativa para enriquecer tecidos e células que utilizam β-ciclodextrina saturada com colesterol envolve o uso de LDL, que se baseia em receptores LDL expressos nos tecidos/células18. Embora essa abordagem ofereça a vantagem de usar o maquinário de homeostase de colesterol natural da célula, ele tem várias limitações. Em primeiro lugar, tecidos e células que não expressam o receptor LDL não podem ser enriquecidos usando esta abordagem. Em segundo lugar, as partículas de LDL contêm outros lipídios, além do colesterol. Especificamente, o LDL é composto pela proteína ApoB100 (25%) e os seguintes lipídios (75%): ~6-8% colesterol, ~45-50% éster de cholesteryl, ~18-24% fosfolipídios e ~4-8% triacilglicerols34. Assim, a entrega de colesterol através de partículas LDL é inespecífica. Em terceiro lugar, o percentual de aumento do teor de colesterol por LDL em tecidos e células que expressam o receptor LDL pode ser significativamente menor do que o aumento observado usando ciclodextrina saturada de colesterol. Por exemplo, em um estudo anterior, o enriquecimento de artérias cerebrais de roedores com colesterol via LDL resultou em apenas um aumento de 10-15% nos níveis de colesterol35. Em contrapartida, o enriquecimento dessas artérias com ciclodextrina saturada com colesterol conforme descrito na seção de protocolo resultou em aumento de >50% no teor de colesterol (Ver Seção Resultados Representativos, Figura 1).
Alteração dos níveis de colesterol nos oócitos xenopus
Os oócitos de xenopus constituem um sistema de expressão heterólogo comumente usado para estudar a função celular e proteica. Estudos anteriores mostraram que a razão do colesterol para o molar fosfolipídeo nos oócitos xenopus é de 0,5 ± 0,136. Devido a esse alto nível intrínseco de colesterol, o aumento do teor de colesterol neste sistema é desafiador, mas pode ser alcançado usando dispersões feitas de fosfolipídeos de membrana e colesterol. Os fosfolipídios que escolhemos para este fim são semelhantes aos utilizados para formar bicamadas lipídicas planares artificiais e incluem L-α-fosphatidyletanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), conforme descrito na seção de protocolo. Essa abordagem pode resultar em >50% de aumento no teor de colesterol (Ver seção Resultados Representativos, Figura 2).
Uma abordagem alternativa para enriquecer os oócitos xenopus com dispersões à base de fosfolipídeos envolve o uso de ciclodextrina saturada com colesterol, que é semelhante à maneira como tecidos e células são enriquecidos. No entanto, descobrimos que essa abordagem é de baixa reprodutibilidade e eficiência, com um aumento médio de ~25% no teor de colesterol. Isso possivelmente se deve à capacidade de carga diferente dessas duas abordagens (Ver seção Resultados Representativos, Figura 3). Em contraste, foi demonstrado que o uso de ciclodextrina para esgotar o colesterol dos oócitos xenopus pode resultar em uma redução de ~40% no teor de colesterol36.
Aqui, focamos no enriquecimento do colesterol de tecidos e células de mamíferos através da aplicação de ciclodextrina saturada de colesterol, e de oócitos xenopus usando liposomos. Ambas as abordagens podem ser aproveitadas para delinear o efeito do aumento dos níveis de colesterol na função proteica. Os mecanismos de modulação do colesterol da função proteica podem envolver interações diretas8 e/ou efeitos indiretos9. Quando o colesterol afeta a função proteica através de interações diretas, o efeito de um aumento nos níveis de colesterol na atividade proteica é provavelmente independente do tipo celular, sistema de expressão ou abordagem de enriquecimento. Por exemplo, utilizamos essas duas abordagens para determinar o efeito do colesterol nos canais de potássio retificador interiormente (GIRK) da proteína G expressos em miócitos atrial37, neurônios hipocampais32,38, HEK29339 células, e xenopus oócitos32,37. Os resultados obtidos nestes estudos foram consistentes: em todos os três tipos de células mamíferas e em oócitos anfíbios a função de canal girk upregulated (ver seção Resultados Representativos, Figura 4, para neurônios hipocampais e os experimentos correspondentes em oócitos xenopus). Além disso, as observações feitas nesses estudos também foram consistentes com os resultados de estudos realizados em miócitos atrial37,40 e neurônios hipocampais32,38 recém-isolados de animais submetidos a uma dieta de colesterol elevado40. Notavelmente, o enriquecimento do colesterol de neurônios hipocampais usando MβCD reverteu o efeito da terapia atorvastatina usada para lidar com o impacto da dieta de colesterol alto tanto nos níveis de colesterol quanto na função GIRK38. Em outros estudos, investigou-se o efeito das mutações na sensibilidade ao colesterol do canal de potássio kir2.1 retificador interiormente usando tanto os oócitos de Xenopus quanto as células HEK29341. Novamente, o efeito das mutações na sensibilidade do canal foi semelhante nos dois sistemas.
As aplicações de ambos os métodos de enriquecimento para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos são numerosas. Em particular, o uso de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer células e tecidos é muito comum em grande parte devido à sua especificidade. Exemplos recentes dessa abordagem incluem a determinação do impacto do colesterol na ativação do canal HERG e nos mecanismos subjacentes42, a descoberta de que o colesterol ativa o receptor acoplado à proteína G suavizado para promover a sinalização de Hedgehog43, e a identificação do papel do colesterol na biomecânica das células-tronco e na adipogênese através das proteínas de ligação associadas à membrana44. Em nosso próprio trabalho, utilizamos o enriquecimento de tecido mamífero com o complexo mβCD:colesterol para estudar o efeito do enriquecimento do colesterol na função básica e o perfil farmacológico dos canais de cálcio e tensão-gated de grande condutância (BK, MaxiK) no músculo liso vascular35,45,46. Em outros estudos, utilizou-se a abordagem de dispersão baseada em fosfolipíptos para enriquecer oócitos de Xenopus com colesterol para determinar os papéis de diferentes regiões em Kir2.1 e girk na sensibilidade ao colesterol41,47,48,49, bem como para determinar locais de ligação de colesterol putativo nesses canais32,50,51.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos para enriquecer tecidos e células de mamíferos e oócitos xenopus com colesterol constituem uma poderosa ferramenta para investigar o efeito de níveis elevados de colesterol em espécies moleculares individuais, em sistemas macromoleculares complexos (por exemplo, proteínas), e na função celular e de órgãos. Neste artigo, descrevemos duas abordagens complementares que facilitam tais estudos. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando MβCD saturado com coleste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Fundo de Desenvolvimento de Cientistas (11SDG5190025) da American Heart Association (para A.R.-D.), e pelo National Institute of Health R01 concede AA-023764 (para A.N.B.), e HL-104631 e R37 AA-11560 (para A.M.D.).
Materials
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
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