Kvantificering leverstørrelse i Larval Zebrafish Ved hjælp af Brightfield Mikroskopi
Summary
Her demonstrerer vi en metode til kvantificering af leverstørrelse i larvezebrafisk, hvilket giver mulighed for at vurdere virkningerne af genetiske og farmakologiske manipulationer på levervækst og udvikling.
Abstract
I flere transgene zebrafisk modeller af hepatocellulære karcinom (HCC), hepatomegaly kan observeres i de tidlige larve stadier. Kvantificering larve lever størrelse i zebrafisk HCC modeller giver et middel til hurtigt at vurdere virkningerne af narkotika og andre manipulationer på en oncogene-relaterede fænotype. Her viser vi, hvordan du løser zebrafisk larver, dissekere væv omkring leveren, fotografere lever ved hjælp af lyse-felt mikroskopi, måle leverområdet, og analysere resultater. Denne protokol muliggør hurtig, præcis kvantificering af leverstørrelse. Da denne metode indebærer måling af leverområdet, kan det undervurdere forskelle i levervolumen, og komplementære metoder er nødvendige for at skelne mellem ændringer i cellestørrelse og ændringer i celletal. Den dissektion teknik, der er beskrevet heri er et glimrende værktøj til at visualisere leveren, tarmen, og bugspytkirtlen i deres naturlige positioner for utallige downstream applikationer, herunder immunfluorescens farvning og in situ hybridisering. Den beskrevne strategi for kvantificering larve lever størrelse gælder for mange aspekter af leverudvikling og regenerering.
Introduction
Hepatocellulære karcinom (HCC) er den mest almindelige primære malignitet i leveren1 og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed2. For bedre at forstå mekanismer af hepatocarcinogenese og identificere potentielle HCC terapeutiske, vi og andre har udviklet transgene zebrafisk, hvor hepatocyt-specifikke udtryk for onkogener såsom β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse zebrafisk, leverudvidelsen er noteret så tidligt som 6 dage efter befrugtning (dpf), hvilket giver en letkøbt platform til at teste virkningerne af narkotika og genetiske ændringer på oncogene-drevet leverovervækst. Nøjagtig og præcis måling af larvelever størrelse er afgørende for bestemmelse af virkningerne af disse manipulationer.
Leverstørrelse og form kan vurderes semi-kvantitativt i faste zebrafisk larver ved CY3-SA mærkning9 eller i levende zebrafisk larver ved hjælp af hepatocyt-specifikke fluorescerende reportere og fluorescens dissekere mikroskopi5,6. Sidstnævnte metode er relativt hurtig, og dens manglende præcision kan løses ved at fotografere og måle området for hver lever ved hjælp af billedbehandling software7,10. Men, Det kan være teknisk udfordrende at ensartet position alle levende larver i et eksperiment, således at to-dimensionelle leverområde er en nøjagtig repræsentation af leverens størrelse. En lignende teknik til kvantificering af leverstørrelse indebærer brug af lysplade fluorescens mikroskopi til at kvantificere larve levervolumen8,hvilket kan være mere præcis til påvisning af størrelsesforskelle, når leveren er udvidet ikke-ensartet i forskellige dimensioner. Fluorescens-aktiverede cellesortering (FACS) kan bruges til at tælle antallet af fluorescerende mærket hepatocytter og andre levercelletyper i larvelever8,11. I denne metode, larve lever er samlet og dissociated, så oplysninger om individuelle leverstørrelse og form er tabt. Kombineret med en anden leverstørrelsebestemmelsesmetode muliggør FACS differentiering mellem øget celletal (hyperplasi) og øget cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metoder anvender dyr fluorescensteknologi (mikroskop- eller cellesortering) og kræver, bortset fra CY3-SA-mærkning, mærkning af hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detaljer en metode til kvantificering zebrafisk larve lever område ved hjælp af lyse felt mikroskopi og billedbehandling software3,12,13,14. Denne protokol muliggør præcis kvantificering af området for de enkelte lever på stedet uden brug af fluorescensmikroskopi. Mens analysere leverstørrelse, vi blinde billedet identitet til at reducere investigator bias og forbedre videnskabelige stringens15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantificering af leverstørrelse er afgørende i undersøgelser med henblik på at forstå leverudvikling, regenerering, og oncogenesis. Protokollen beskrevet her er en relativt hurtig, nem og billig teknik til leverstørrelse kvantificering i larve zebrafisk. At udvise passende forsigtighed, mens du udfører visse aspekter af protokollen kan støtte i øget nøjagtighed af resultater og nedsat frustration.
Korrekt fiksering af larver er afgørende for at få velbevarede biologiske prøver og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Maurine Hobbs og den centraliserede Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for at levere zebrafiskopdræt, laboratorierum og udstyr til at udføre dele af denne forskning. Udvidelse af Zar-familien understøttes til dels af NIH-tilskuddet # 1G20OD018369-01. Vi vil også gerne takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for zebrafisk pleje. Vi vil gerne takke Kenneth Kompass for hjælp med R programmering. Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud fra Huntsman Cancer Foundation (i samarbejde med tilskud P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
