Kvantifisere leverstørrelse i Larval Sebrafisk Ved hjelp av Brightfield Microscopy
Summary
Her viser vi en metode for å kvantifisere leverstørrelse i larval sebrafisk, noe som gir en måte å vurdere effekten av genetiske og farmakologiske manipulasjoner på levervekst og utvikling.
Abstract
I flere transgene sebrafiskmodeller av hepatocellulært karsinom (HCC) kan hepamegali observeres under tidlige larvestadier. Kvantifiserende larval leverstørrelse i sebrafisk HCC modeller gir et middel til raskt å vurdere effekten av narkotika og andre manipulasjoner på en onkogen-relatert fenotype. Her viser vi hvordan du fikser sebrafisk larver, dissekerer vevet rundt leveren, fotograferer lever ved hjelp av lyse feltmikroskopi, måler leverområdet og analyserer resultater. Denne protokollen muliggjør rask, presis kvantifisering av leverstørrelse. Siden denne metoden innebærer å måle leverområdet, kan det undervurdere forskjeller i levervolum, og komplementære metoder er nødvendig for å skille mellom endringer i cellestørrelse og endringer i cellenummer. Disseksjonsteknikken som er beskrevet her, er et utmerket verktøy for å visualisere leveren, tarmen og bukspyttkjertelen i naturlige posisjoner for utallige nedstrøms applikasjoner, inkludert immunfluorescensfarging og in situ hybridisering. Den beskrevne strategien for å kvantifisere larval leverstørrelse gjelder for mange aspekter av leverutvikling og regenerering.
Introduction
Hepatocellulært karsinom (HCC) er den vanligste primære maligniteten i leveren1 og den tredje ledende årsaken til kreftrelatert dødelighet2. For bedre å forstå mekanismer for hepatokarsinogenese og identifisere potensielle HCC-terapeutiske midler, har vi og andre utviklet transgene sebrafisk der hepatoktino-spesifikt uttrykk for onkogenes som β-catenin3,4, Kras(V12)5,6,Myc7eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse sebrafiskene er leverforstørrelse notert så tidlig som 6 dager etter befruktning (dpf), noe som gir en facile plattform for å teste effekten av narkotika og genetiske endringer på onkogendrevet leverovervekst. Nøyaktig og presis måling av larval leverstørrelse er avgjørende for å bestemme effekten av disse manipulasjonene.
Leverstørrelse og form kan vurderes semikvantitativt i faste sebrafisk larver ved CY3-SA merking9 eller i levende sebrafisk larver ved hjelp av hepatocytterspesifikke fluorescerende reportere og fluorescensdissekermikroskopi5,6. Sistnevnte metode er relativt rask, og mangelen på presisjon kan løses ved å fotografere og måle området av hver lever ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare7,10. Det kan imidlertid være teknisk utfordrende å jevnt plassere alle levende larver i et eksperiment slik at todimensjonalt leverområde er en nøyaktig representasjon av leverstørrelse. En lignende teknikk for å kvantifisere leverstørrelse innebærer å bruke lysark fluorescens mikroskopi for å kvantifisere larval levervolum8, som kan være mer nøyaktig for å oppdage størrelsesforskjeller når leveren utvides ikke-jevnt i forskjellige dimensjoner. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan brukes til å telle antall fluorescerende merkede hepatocytter og andre levercelletyper i larvallever8,11. I denne metoden er larvallever samlet og dissosiert, så informasjon om individuell leverstørrelse og form går tapt. I kombinasjon med en annen metode for bestemmelse av leverstørrelse muliggjør FACS differensiering mellom økt cellenummer (hyperplasi) og økt cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metodene bruker dyr fluorescensteknologi (mikroskop eller cellesortering) og, med unntak av CY3-SA-merking, krever merking av hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detalj en metode for å kvantifisere sebrafisk larveleverområde ved hjelp av lyse felt mikroskopi og bildebehandling programvare3,12,13,14. Denne protokollen muliggjør nøyaktig kvantifisering av arealet av individuelle lever in situ uten bruk av fluorescens mikroskopi. Mens du analyserer leverstørrelsen, blinder vi bildeidentiteten for å redusere etterforskerbias og forbedre vitenskapelig rigor15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifisering av leverstørrelse er avgjørende i studier som tar sikte på å forstå leverutvikling, regenerering og onkogenese. Protokollen som er beskrevet her er en relativt rask, enkel og billig teknikk for leverstørrelse kvantifisering i larval sebrafisk. Utøvelse av passende forsiktighet mens du utfører visse aspekter av protokollen kan hjelpe til med økt nøyaktighet av resultater og redusert frustrasjon.
Riktig fiksering av larver er avgjørende for å få godt bevarte biologisk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne anerkjenne Maurine Hobbs og centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for å gi sebrafisk husdyrhold, laboratorieplass og utstyr for å utføre deler av denne forskningen. Utvidelse av CZAR støttes delvis av NIH stipend # 1G20OD018369-01. Vi vil også takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for sebrafiskomsorg. Vi vil gjerne takke Kenneth Kompass for hjelp med R-programmering. Dette arbeidet ble delvis finansiert av tilskudd fra Huntsman Cancer Foundation (i forbindelse med stipend P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
