Kvantifiera leverstorlek i Larval Zebrafisk Med Brightfield Mikroskopi
Summary
Här visar vi en metod för att kvantifiera leverstorlek i larv zebrafisk, vilket ger ett sätt att bedöma effekterna av genetiska och farmakologiska manipulationer på levertillväxt och utveckling.
Abstract
I flera transgena zebrafisk modeller av hepatocellulärcarcinom (HCC), hepatomegali kan observeras under tidiga larvstadier. Kvantifiera larval leverstorlek i zebrafisk HCC modeller ger ett sätt att snabbt bedöma effekterna av läkemedel och andra manipulationer på en onkogen-relaterade fenotyp. Här visar vi hur man fixar zebrafisklarver, dissekerar vävnaderna kring levern, fotograferar lever med hjälp av ljusfältsmikroskopi, mäter leverområdet och analyserar resultat. Detta protokoll möjliggör snabb, exakt kvantifiering av leverstorlek. Eftersom denna metod innebär att mäta leverområdet, Det kan underskatta skillnader i levervolym, och kompletterande metoder krävs för att skilja mellan förändringar i cellstorlek och förändringar i cellnummer. Den dissektion teknik som beskrivs häri är ett utmärkt verktyg för att visualisera lever, tarm och bukspottkörteln i sina naturliga positioner för otaliga nedströms applikationer inklusive immunofluorescens färgning och in situ hybridisering. Den beskrivna strategin för kvantifiering av larval leverstorlek är tillämplig på många aspekter av leverutveckling och förnyelse.
Introduction
Hepatocellulär karcinom (HCC) är den vanligaste primära maligniteten ilevern 1 och den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet2. För att bättre förstå mekanismer av hepatocarcinogenes och identifiera potentiella HCC therapeutics, vi och andra har utvecklat transgena zebrafisk där hepatocyte-specifika uttryck för onkogener såsom β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, eller Yap18 leder till HCC hos vuxna djur. I dessa zebrafisk noteras leverutvidgningen så tidigt som 6 dagar efter befruktning (dpf), vilket ger en facile plattform för att testa effekterna av läkemedel och genetiska förändringar på onkogendriven leveröverväxt. Exakt och exakt mätning av larval leverstorlek är viktigt för att fastställa effekterna av dessa manipulationer.
Leverstorlek och form kan bedömas semikvantitativt i fasta zebrafisklarver med CY3-SA med etiketten9 eller i levande zebrafisklarver med hepatocytespecifika fluorescerande reportrar och fluorescerande dissekering slemhinne imikroskopi 5,6. Den senare metoden är relativt snabb, och dess brist på precision kan åtgärdas genom att fotografera och mäta området för varje lever med hjälp av bildbehandling programvara7,10. Emellertid, Det kan vara tekniskt utmanande att enhetligt placera alla levande larver i ett experiment så att tvådimensionella leverområdet är en korrekt representation av leverstorlek. En liknande teknik för kvantifiering leverstorlek innebär att använda ljusblad fluorescens mikroskopi för att kvantifiera larv levervolym8, vilket kan vara mer exakt för att upptäcka storleksskillnader när levern utökas icke-enhetligt i olika dimensioner. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan användas för att räkna antalet fluorescerande märkta hepatocyter och andra levercelltyper i larvallever8,11. I denna metod, larv lever är poolade och dissociated, så information om enskilda leverstorlek och form går förlorad. I kombination med en annan leverstorlek bestämningsmetod, FACS möjliggör differentiering mellan ökat cellantal (hyperplasi) och ökad cellstorlek (hypertrofi). Alla dessa metoder använder dyra fluorescensteknik (mikroskop eller cellsorterare) och, med undantag för CY3-SA-märkning, kräver märkning av hepatocyter med en fluorescerande reporter.
Här beskriver vi i detalj en metod för kvantifiering zebrafisk larv leverområde med hjälp av ljusa fält mikroskopi och bildbehandling programvara3,12,13,14. Detta protokoll möjliggör exakt kvantifiering av området för enskilda lever på plats utan användning av fluorescensmikroskopi. Medan analysera leverstorlek, blindvi bilden identitet för att minska utredare bias och förbättra vetenskaplig stringens15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifiering av leverstorlek är avgörande i studier som syftar till att förstå leverutveckling, förnyelse och onkogenes. Protokollet beskrivs här är en relativt snabb, enkel och billig teknik för leverstorlek kvantifiering i larval zebrafisk. Att iaktta lämplig försiktighet när du utför vissa aspekter av protokollet kan hjälpa till att öka noggrannheten i resultaten och minskad frustration.
Korrekt fixering av larverna är avgörande för att få välbevarade biologiska prover o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill erkänna Maurine Hobbs och centraliserad zebrafisk Animal Resource (CZAR) vid University of Utah för att tillhandahålla zebrafisk hållning, laboratorieutrymme och utrustning för att utföra delar av denna forskning. Utbyggnaden av CZAR stöds delvis av NIH-bidrag # 1G20OD018369-01. Vi vill också tacka Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum och Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility för zebrafisk vård. Vi vill tacka Kenneth Kompass för hjälp med R programmering. Detta arbete finansierades delvis genom bidrag från Huntsman Cancer Foundation (i samband med bidrag P30 CA042014 tilldelas Huntsman Cancer Institute) (KJE) och NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
