यहां हम एक कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल में छवि माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज के लिए समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है।
कीमोटैक्सिस रासायनिक ढाल के साथ कोशिकाओं का रिसेप्टर-मध्यस्थता मार्गदर्शन है, जबकि रसायन रसायन द्वारा यादृच्छिक कोशिका गतिशीलता की उत्तेजना है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जुड़ाव और तैनाती के लिए केमोकिनेसिस और कीमोटैक्सिस मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, केमोकिन्स (कीमोटैक्टिक साइटोकिन्स) सूजन की असाधारण साइटों में तेजी से परिसंचारी न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स की भर्ती कर सकते हैं। कीमोआकर्षितेंट रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के बड़े परिवार से संबंधित हैं। कैसे कीमोआकर्षितेंट (यानी, लिगामेंट) ग्रेडिएंट्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग के माध्यम से प्रत्यक्ष सेल माइग्रेशन अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आता है। इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में, न्यूट्रोफिल विट्रो में कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय मॉडल कोशिकाएं हैं। यहां हम माउस निवासी मैक्रोफेज के लिए सिलवाया एक वास्तविक समय दो आयामी (2डी) कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं, जो पारंपरिक रूप से अध्ययन करने में अधिक कठिन रहा है। मैक्रोफेज 2 डी सतह पर ~ 1 μm/मिन की धीमी गति से चलते हैं और बिंदु-स्रोत प्रवासन परखों (जैसे, कीमोप्रोवेंट से भरे माइक्रोपाइप्ट की नोक की ओर प्रवास) न्यूट्रोफिल या डिक्टिओस्टेलियम डिस्कोइडियमकी तुलना में कम अच्छी तरह से अनुकूल होते हैं, जो परिमाण के क्रम को तेजी से आगे बढ़ाते हैं । व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ट्रांसवेल रूप विभिन्न पदार्थों की कीमोटैक्टिक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन सेल आकृति विज्ञान, वेग या कीमोटैक्टिक नेविगेशन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। यहां हम एक समय-चूक माइक्रोस्कोपी आधारित मैक्रोफेज कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं जो सेल वेग और कीमोटैक्टिक दक्षता के मात्राकरण की अनुमति देता है और ट्रांसड्यूसर, सिग्नल पाथवे और कीमोटैक्सिस के प्रभावकों को रेखांकित करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।
प्रतिरक्षा कोशिकाएं आमतौर पर एक अमीबोइड फैशन1,,2में 2डी सतह पर समान रूप से माइग्रेट करती हैं, जिसमें सामने के फलाव, पूर्णांक-मध्यस्थता कोशिका आसंजन और पीछे की वापसी के बार-बार चक्र शामिल होते हैं। एक शर्त कदम सेल ध्रुवीकरण है, जिसमें कोशिकाओं के सामने और पीछे फार्म3समाप्त होता है । कीमोटैक्सिस जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा कीमोआकर्षितेंट का पता लगाने और झिल्ली द्वारा लंगर डाले गए विषममेट्रिमेरिक जी प्रोटीन और छोटे मोनोमेरिक जी प्रोटीन, साथ ही फॉस्फोलिपिड-बाउंड ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर्स (जीईएफ)4,,5द्वारा मध्यस्थता करने वाले एक जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क के साथ शुरू होता है । Cdc42 और आरएसी उपपरिवारों के Rho GTPases की सक्रियता सामने6 और Rho उपपरिवार के सदस्यों, विशेष रूप से RhoA के सदस्यों पर फैलाना प्रेरित, पीछे5,,7के संकुचन को सक्रिय । एक त्रि-आयामी (3 डी) वातावरण में, ल्यूकोसाइट माइग्रेशन के लिए पूर्णांक काफी हद तक बेमानी हैं और रोडा संकीर्ण मार्ग8के माध्यम से कोशिकाओं को फैलाएंगे के लिए अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है, जबकि Cdc42- या आरएसी-प्रेरित Arp2/3 सक्रियण कीमोटैक्टिक स्टीयरिंग9,,10के लिए महत्वपूर्ण रहता है।
प्रतिरक्षा कोशिकाओं को विशेष रूप से ऊतक चोट, रोगजनक आक्रमण और सूजन की सेटिंग्स में विभिन्न कीमोआकर्षितेंट का सामना करना पड़ सकता है। फैगोसाइट्स पूरक C3a और C5a पर व्यक्त किए गए एंडोजेनस कीमोआकर्षितेंट तेजी से पूरक झरना की सक्रियता से उत्पन्न होते हैं, और पूरक C3a और C5a रिसेप्टर्स द्वारा पहचाने जाते हैं। इसी तरह, परिगल कोशिकाएं फोरिल पेप्टाइड रिसेप्टर्स के माध्यम से फागोसाइट्स की भर्ती करती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न के साथ-साथ बैक्टीरिया-व्युत्पन्न फोरिल पेप्टाइड्स11को पहचानती हैं। प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी केमोकिन्स के लिए जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं, जो होमोस्टेसिस और सूजन दोनों के दौरान प्रतिरक्षा सेल तस्करी के नियमन में शामिल कीमोआकर्षितेंट पेप्टाइड्स का एक बड़ा परिवार है। चेमोकिनको पहले दो साइस्टीन (सी) अवशेषों की रिक्ति के आधार पर चार समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: सी, सीसी, सीएक्ससी और सीएक्स3सी साइटोकिन्स, जहां एक्स एक अमीनो एसिड है। इस प्रकार, वीवो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में अत्यधिक जटिल स्थानिक और लौकिक संकेतों का उचित जवाब देने की आवश्यकता होती है, जिससे कीमोटैक्सियों का अध्ययन एक चुनौतीपूर्ण कार्य होता है। नीचे हम कीमोटैक्सिस का एक संक्षिप्त इतिहास प्रदान करते हैं, जो इंट्रावेटल इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ शुरू हुआ।
ल्यूकोसाइट कीमोटैक्सिस का अध्ययन 188812में वापस आता है, जब नेत्र रोग विशेषज्ञ थियोडोर कार्ल गुस्ताव लेबर ने स्पष्ट रूप से ल्यूकोसाइट्स के निर्देशित प्रवास का वर्णन किया, और माइकोटिक (फंगल) केराटिटिस के मॉडल में सूजन की साइटों पर संचय किया। लेबर ने जोर देकर कहा कि रोगजनक-व्युत्पन्न पदार्थों द्वारा अतिरिक्त ल्यूकोसाइट्स का आकर्षण phagocytosis के माध्यम से हानिकारक सूक्ष्मजीवों के उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है, जिसे मेचनिकॉफ (जिसे मेट्श्निकॉफ के नाम से भी जाना जाता है) ने इसी दशकमें 13में वर्णित किया था । 1 9 20 के दशक में क्लार्क और क्लार्क14,,15द्वारा वीवो प्रयोगों का भी प्रदर्शन किया गया था, जिन्होंने टैडपोल की पारदर्शिता का लाभ उठाया और दिखाया कि क्रॉटन तेल14 या अन्य परेशानियों से प्रेरित बाँझ सूजन15 ने रक्त वाहिकाओं का पालन करने के लिए ल्यूकोसाइट्स का कारण बना, जिसके बाद डायपेडेसिस (ट्रांसेंडोथेलियाल माइग्रेशन) और परेशानी की ओर ऊतक रिक्त ियों के माध्यम से तेजी से प्रवास हुआ। जीन कोमंडन16 द्वारा विकसित माइक्रोसिनेटोग्राफी विधि का उपयोग करके इन विट्रो प्रयोगों से पता चला कि ल्यूकोसाइट्स बैक्टीरिया17जैसे पार्टिकुलेट कीमोआकर्षितेंट स्रोत की ओर चले गए । उस समय, कीमोटैक्टिक कारकों की आणविक पहचान अज्ञात थी। 1960 के दशक में, स्टीफन Boyden18 मांयता प्राप्त है कि तकनीक घुलनशील पदार्थों की कीमोटैक्टिक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कमी थी । उन्होंने एक कक्ष तैयार किया, जिसे बाद में बॉयडन चैंबर के नाम से जाना जाता है, जिसमें फिल्टर पेपर झिल्ली से अलग दो डिब्बे थे। ऊपरी डिब्बे में एक सेल निलंबन जोड़ा जाता है और परीक्षण पदार्थ को या तो दोनों डिब्बों या केवल निचले डिब्बे में जोड़ा जाता है। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, फिल्टर झिल्ली को हटा दिया जाता है, और कोशिकाओं को स्थिर और दाग दिया जाता है। तुलना करके कि कितनी कोशिकाएं फिल्टर झिल्ली को दोनों डिब्बों में परीक्षण पदार्थ के साथ निचले कुएं की ओर स्थानांतरित करती हैं, न तो डिब्बे में, या केवल निचले डिब्बे में, कीमोटैक्टिक गतिविधि निर्धारित की जा सकती है। ट्रांसवेल रूप आज भी लोकप्रिय हैं और विभिन्न तरीकों से संशोधित किए गए हैं, जिनमें परिभाषित ताकना आकार और घनत्व19,,20के साथ विभिन्न पॉलीकार्बोनेट झिल्ली का उपयोग शामिल है। ट्रांसवेल रूपों की एक प्रमुख खामी यह है कि माइग्रेट होने वाली कोशिकाओं की सीधे कल्पना करना अव्यावहारिक है और झिल्ली के पार माइग्रेशन पथ आमतौर पर प्रतिरक्षा कोशिका के व्यास से अधिक नहीं होता है।
सैली एच Zigmond एक कीमोटैक्सिस चैंबर21 है कि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर ढाल गठन और सेल आकृति विज्ञान दोनों के दृश्य सक्षम विकसित की है । कक्ष में दो समानांतर रैखिक कुओं के साथ एक प्लेक्सीग्लास (ऐक्रेलिक) स्लाइड शामिल है, प्रत्येक में ~ 100 माइक्रोन की मात्रा होती है, जो स्लाइड के ऊपरी विमान के नीचे 1 मिमी चौड़े पुल 3-10 माइक्रोन से अलग होती है। कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक कवरस्लिप को उलटा किया जाता है और स्लाइड पर रखा जाता है जैसे कि यह दो कुओं तक फैला होता है। कुओं में से एक के लिए एक कीमोआकर्षितेंट के अलावा, पुल के पार एक खड़ी कीमोआकर्षितेंट ढाल रूपों, आम तौर पर 30-90 मिनट के भीतर । Zigmond कक्ष में मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (ग्रैनुलोसाइट्स) खुद को कीमोआकर्षितेंट की ओर उन्मुख देखा जाता है । Zigmond चैंबर के रूपों की सूचना दी गई है, डन22 और Insall23 कक्षों सहित, दोनों जिनमें से एक 1 मिमी चौड़ा पुल से अलग दो कुओं में रखा कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक कवरस्लिप का उपयोग करें । डन चैंबर में एक गोलाकार पुल से अलग गाढ़ा कुएं होते हैं, जबकि इंसऑल चैंबर अधिक बारीकी से जिगमंड चैंबर से संबंधित है, लेकिन दो अलग-अलग चौड़ाई, 0.5 मिमी और 1 मिमी के पुल प्रदान करता है। एक उपन्यास कीमोटैक्सिस चैंबर, जिसका नाम माइक्रो-स्लाइड कीमोटैक्सिस और प्लास्टिक इंजेक्शन मोल्डिंग द्वारा निर्मित, जेमगेल एट अल24द्वारा वर्णित किया गया था। कीमोटैक्सिस चैंबर में 2 मिमी की लंबाई और 70 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ 1 मिमी चौड़े चैनल द्वारा अलग किए गए दो 40 माइक्रोनल जलाशय होते हैं। कक्ष के नीचे एक गैस परगम्य, पतली प्लास्टिक शीट के साथ एक ही मोटाई और एक नंबर 1.5 ग्लास कवरस्लिप24के ऑप्टिकल गुणों से बनता है। यहां हम एक कीमोटैक्टिक (पूरक C5a) ढाल में 14 घंटे तक के लिए माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज के प्रवास की कल्पना करने के लिए μ-स्लाइड कीमोटैक्सिस चैंबर का उपयोग करके कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं।
इंट्राग्लाइज्ड इमेजिंग 1 9वीं शताब्दी की तारीखें हैं और अपने प्राकृतिक वातावरण में जीवित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने का साधन प्रदान करती हैं। हालांकि, आज की उन्नत माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक तकनीकों के साथ भी वीवो में विशिष्ट कीमोआकर्षितेंट के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करना मुश्किल है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, Boyden18 1960 के दशक में ट्रांसवेल रूप विकसित की है, लेकिन इन अंत बिंदु परख कैसे कोशिकाओं को वास्तव में कीमोआकर्षितेंट की ओर चले गए, यह मुश्किल केमोकिनेसिस भेद करने के लिए, एक रासायनिक क्यू३२द्वारा यादृच्छिक प्रवास उत्तेजित, और कीमोटैक्सिस, एक दूसरे से रासायनिक उत्तेजनाओं की उच्च सांद्रता की ओर प्रवास३३ । इस समस्या को एक पुल के साथ विभिन्न खुले कक्षों को डिजाइन करके हल किया गया था, आमतौर पर 1 मिमी चौड़ा, दो जलाशयों के बीच स्थित है और एक उद्देश्य लेंस21,,22,,23द्वारा सुलभ है। एक उल्टे कवर स्लिप लागू करना, जो अनुयायी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है, कक्षों को बंद कर देता है और कीमोआकर्षितेंट को पुल के पार जलाशयों में से एक में जोड़ा जाता है, जिससे एकाग्रता ढाल बन जाती है। यहां हम एक ही सिद्धांत का उपयोग कर केमोटैक्सीपर का वर्णन करते हैं, लेकिन चार भरने वाले बंदरगाहों की विशेषता वाले बंद कक्ष का उपयोग करते हैं। इस प्रणाली और समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने छवि माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज को कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल31,,34,,35,,36में माइग्रेट करने के लिए एक परख विकसित की। नॉकआउट माउस मॉडल के साथ संयुक्त यह परख, मैक्रोफेज आकृति विज्ञान, गतिशीलता, और कीमोटैक्सिस,31,34,,35,36,,37में विभिन्न Rho GTPases और मोटर प्रोटीन की भूमिकाओं की जांच में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई साबित हुई।, हमने 2 डी सतह पर या 3डी कोलेजन प्रकार आई मैट्रिक्स38में माइग्रेट होने वाले मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट्स की छवि के लिए इस दृष्टिकोण का भी उपयोग किया है। इसके अलावा, परख माउस बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज या मैक्रोफेज के लिए उपयुक्त है जो सशर्त अमर माइलॉयड अग्रदूत कोशिकाओं39,,40से प्राप्त होता है। हमने पहले पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) बैग का उपयोग किया है, जिसमें संस्कृति अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए ल्यूयर एडाप्टर हैं और मैक्रोफेज34प्राप्त करते हैं। पीटीएफई बैग का लाभ यह है कि कोशिकाओं को 20-30 मिन के लिए बर्फ पर बैग रखने के बाद आसानी से फिर से निलंबित किया जा सकता है और उपयोग के लिए तैयार किया जा सकता है ध्यान दें कि हम कोशिकाओं को शुरू करने से पहले कीमोटैक्सिस स्लाइड अवलोकन क्षेत्र को प्रीफिल करते हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि अवांछित हवा के बुलबुले को बाद में (चर सफलता के साथ) निकाला जा सकता है और पूर्वबद्ध अवलोकन क्षेत्र पाइपिंग द्वारा सेल निलंबन की धीमी शुरुआत को सक्षम बनाता है। प्रीफिलिंग, हालांकि, संभावना बढ़ जाती है कि माध्यम आंशिक रूप से एक या दोनों फ्लैंकिंग जलाशयों में प्रवाहित होगा, जो अवलोकन क्षेत्र से परे कोशिकाओं के सीडिंग को बढ़ावा देगा। वैकल्पिक रूप से, सेल निलंबन सीधे एक शुष्क अवलोकन क्षेत्र में पाइप किया जा सकता है, लेकिन अवांछित हवा बुलबुले बाद में निष्कासित नहीं किया जा सकता है।
माउस की पेरिटोनियल गुहा में कोशिकाओं की दो मुख्य आबादी होती है: F4/80+ मैक्रोफेज और (छोटे) CD19+ बी कोशिकाएं, लगभग 1:2(चित्रा 4A)के अनुपात में। ये दो सेल आबादी पेरिटोनियल गुहा कोशिकाओं के ९५% से अधिक के लिए खाते हैं, जबकि शेष F4/80-/CD19-कोशिकाओं को आमतौर पर CD11c+ कोशिकाओं (dendritic कोशिकाओं) या CD3+ कोशिकाओं (टी कोशिकाओं) के रूप में पहचाना जा सकता है ।–– कमजोर अनुयायी बी कोशिकाओं को मध्यम(चित्रा 2)के साथ जलाशयों को भरने के दौरान अवलोकन क्षेत्र से धोया जाता है। दो जलाशयों में से एक में कीमोआकर्षितेंट जोड़ने के बाद, समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक विकसित कीमोआकर्षितेंट ढाल में पलायन करने वाली शेष कोशिकाओं (मैक्रोफेज) को छवि देने के लिए किया जा सकता है। अवलोकन क्षेत्र में पूरक C5a ढाल के गठन, एक जलाशय से दूसरे जलाशय में प्रसार के माध्यम से, इसी तरह के आणविक वजन के साथ एक फ्लोरोसेंट रंग का उपयोग कर नकली किया जा सकता है । Recombinant माउस के पूरक C5a के लिए एक अच्छा विकल्प (अनुमानित आणविक वजन, 9.0 केडीए) फ्लोरोसेंटली लेबल dextran (10 केडीए)31है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, कीमोटैक्सिस स्लाइड के दो जलाशयों को जोड़ने वाले संकीर्ण चैनल (अवलोकन क्षेत्र) में फ्लोरेसेंस ग्रेडिएंट को निश्चित अंतराल पर मापा जा सकता है और विभिन्न समय बिंदुओं पर एकाग्रता प्रोफाइलको 24,,31प्लॉट किया जा सकता है। हम नियमित रूप से प्रसार और ढाल गठन का एक सुविधाजनक दृश्य संकेतक प्रदान करने के लिए कीमोआकर्षितेंट माध्यम में एक नॉनफ्लोरोसेंट, ब्लू डाये (पेटेंट ब्लू वी) जोड़ते हैं। एक जलाशय में नीले, कीमोआकर्षितेंट युक्त माध्यम के 15 μL शुरू करने के 1 घंटे के भीतर, जलाशय समान रूप से नीला दिखाई देता है और, प्रसार के Fick के कानूनों के अनुसार, जलाशयों को जोड़ने के संकीर्ण अवलोकन क्षेत्र में एक ढाल बनेगी(चित्रा 3B)। समान रूप से वितरित होने के लिए सॉल्यूट (नीली रंग या कीमोआकर्षितेंट) के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो स्वचालित सेल ट्रैकिंग के लिए लाभ प्रदान करता है, क्योंकि फ्लोरोसेंटी लेबल वाली कोशिकाओं को पृष्ठभूमि से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक और लाभ यह है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी को फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ सतह मार्कर लेबलिंग के बाद चुनिंदा रूप से ट्रैक किया जा सकता है। हमने छवि मानव परिधीय रक्त CD14+ कोशिकाओं (मोनोसाइट्स) में माइग्रेट करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया जो कीमोटैक्टिक एफएमएलपी (एन-फॉरिलमेथथिओनी-ल्यूसिल-फिनाइललिन) ढाल38में माइग्रेट करते हैं। इसी तरह, फ्लोरोसेंट एंटी-F4/80 एंटीबॉडी का उपयोग कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल में माइग्रेट माउस मैक्रोफेज छवि के लिए किया जा सकता है। फोटोटॉक्सिकिटी फ्लोरेसेंस इमेजिंग41का उपयोग करने का एक संभावित नुकसान है। इसे विभिन्नसाधनों 42द्वारा कम किया जा सकता है, जिसमें लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य के साथ उत्साहित फ्लोरोफोरस का उपयोग करना और माध्यम में एंटीऑक्सीडेंट जोड़ना शामिल है। वैकल्पिक रूप से, लेबल कोशिकाओं को शुरू में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है और बाद में समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजकिया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में, मामूली कम वेग पर चलती कोशिकाओं, जैसे ~1 μm/min (मैक्रोफेज) या ~ 4 μm/मिन (मोनोसाइट्स), रुक-रुक कर मिनटों के अंतराल पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से३८सहन किया जाता है । हमने पहले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और कीमोटैक्सिस स्लाइड का उपयोग 3डी कीमोटैक्सिस परख38,43के लिए किया था। इस मामले में, दोनों जलाशयों को मध्यम और 15 μL कीमोआकर्षितेंट युक्त माध्यम से भरा गया था, जो धीरे-धीरे कोलेजन प्रकार I को अवलोकन क्षेत्र में निलंबित करने वाले माध्यम में निलंबित फ्लोरोसेंटी लेबल वाली कोशिकाओं को पाइप करने से तुरंत पहले जलाशयों में से एक में तैयार किया गया था। इस प्रक्रिया का कठिन हिस्सा कोलेजन प्रकार I की हैंडलिंग है, जो अम्लीय समाधान में केंद्रित है। कोलेजन समाधान के पीएच को सेल निलंबन के साथ बर्फ-ठंडे कोलेजन समाधान को मिलाने से पहले क्षारीय समाधान के अलावा निष्प्रभावी करने की आवश्यकता है। कोलेजन-सेल मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने से कोलेजन बहुलककरण शुरू हो जाएगा। ऊष्मायन के दौरान, स्लाइड को धीरे-धीरे अपनी लंबी धुरी के चारों ओर घुमाया जाना चाहिए ताकि कोशिकाएं एक्स-, वाई-और जेड-एक्सिस दिशाओं में समान रूप से वितरित रहें, जबकि कोलेजन जेल में बहुलक हो जाए। एक संबंधित बंद कीमोटैक्सिस स्लाइड 3 डी कीमोटैक्सिस के लिए उपयुक्त है, जिसमें चार प्लग के बजाय छह प्लग हैं, हाल ही में29वर्णित किए गए हैं । यह प्रणाली कोलेजन-सेल मिश्रण को स्वतंत्र रूप से प्रत्येक फ्लैंकिंग जलाशयों को भरने से पहले अवलोकन क्षेत्र में पेश करने की अनुमति देती है, क्योंकि प्रत्येक जलाशय में एक ही बंदरगाह के बजाय दो भरने वाले बंदरगाह होते हैं।
संक्षेप में, हम एक वास्तविक समय कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं जो 6 या उससे अधिक घंटे की अवधि में कीमोटैक्टिक ढाल में नेविगेट करने वाली कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है। इसके साथ हम मैक्रोफेज पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो भड़काऊ रोगों में प्रमुख भूमिकानिभाते हैं, लेकिन न्यूट्रोफिल और डिक्टिओस्टेलियम अमीबी जैसी तेजी से चलती कोशिकाओं की तुलना में वास्तविक समय कीमोटैक्सिस परख में कम प्रतिनिधित्व किया गया है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को डीएफजी (ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमिन्स्चफ्ट) से अनुदान (एचए 3271/3-2) द्वारा समर्थित किया गया था ।
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |