Her beskriver vi metoder ved hjelp av tidsforløp, fasekontrastmikroskopi til bildemusbosatteperitoneal makrofager i en kjemotaktisk komplement C5a gradient. Protokollene kan utvides til andre immunceller.
Chemotaxis er reseptormediert veiledning av celler langs en kjemisk gradient, mens chemokinese er stimulering av tilfeldig cellemotilitet av et kjemikalie. Chemokinesis og chemotaxis er grunnleggende for mobilisering og distribusjon av immunceller. For eksempel kan chemokiner (kjemotaktiske cytokiner) raskt rekruttere sirkulerende nøytrofiler og monocytter til ekstravaskulære steder av betennelse. Kjemoattractant reseptorer tilhører den store familien av G protein-koblet reseptorer. Hvordan kjemoattractant (dvs. ligand) gradienter direkte cellemigrasjon via G protein-koblet reseptor signalering er ennå ikke fullt ut forstått. Innen immunologi er nøytrofiler populære modellceller for å studere chemotaxis in vitro. Her beskriver vi en todimensjonal (2D) chemotaxis analyse skreddersydd for musbosatte makrofager, som tradisjonelt har vært vanskeligere å studere. Makrofager beveger seg i et sakte tempo på ~ 1 μm / min på en 2D-overflate og er mindre godt egnet for point-source migrasjon analyser (f.eks migrasjon mot spissen av en mikropipette fylt med kjemoattractant) enn nøytrofiler eller Dictyostelium discoideum, som beveger en størrelsesorden raskere. Mye brukt Transwell analyser er nyttige for å studere kjemotaktisk aktivitet av forskjellige stoffer, men gir ikke informasjon om celle morfologi, hastighet, eller kjemotaktisk navigasjon. Her beskriver vi en tidsforløpmikroskopibasert makrofagchemotaxis analyse som tillater kvantifisering av cellehastighet og kjemotaktisk effektivitet og gir en plattform for å avgrense transdusere, signalveier og effektorer av chemotaxis.
Immunceller migrerer vanligvis singly på en 2D-overflate i en amoeboid mote1,2,som innebærer gjentatte sykluser av fremspring av fronten, integrin-mediert celle adhesjon, og tilbaketrekking av baksiden. Et nødvendig trinn er cellepolarisering, der celler danner foran og bak ender3. Chemotaxis starter med påvisning av kjemoattractants av G protein-koblet reseptorer og et komplekst signalnettverk mediert av membran-forankret heterotrimeric G proteiner og små monomeric G proteiner, samt fosfolipid-bundet guanin nukleotid utvekslingfaktorer (GEFs)4,5. Aktivering av Rho GTPases av Cdc42 og Rac underfamilier indusere fremspring på forsiden6 og medlemmer av Rho subfamily, spesielt RhoA, aktivere sammentrekning av de bakre5,7. I et tredimensjonalt (3D) miljø er integrins i stor grad overflødige for leukocytter migrasjon og RhoA blir viktigere for å klemme celler gjennom trange passasjer8, mens Cdc42- eller Rac-indusert Arp2/3 aktivering fortsatt er viktig for kjemotaktisk styring9,10.
Immunceller kan møte forskjellige kjemoattractants, spesielt i innstillingene for vevskade, patogen invasjon, og betennelse. De endogene kjemoattractants uttrykt på phagocytes utfyller C3a og C5a, genereres raskt ved aktivering av komplementkaskade, og gjenkjennes av komplement C3a og C5a reseptorer. Tilsvarende, nekrotiske celler rekruttere phagocytes via formyl peptid reseptorer, som gjenkjenner mitokondrier-avledet samt bakterier-avledet formyl peptider11. Immunceller uttrykker også G protein-koblet reseptorer for chemokiner, en stor familie av kjemoattractant peptider involvert i regulering av immuncellehandel under både homeostase og betennelse. Chemokines er klassifisert i fire grupper avhengig av avstanden til de to første cystein (C) rester: C, CC, CXC, og CX3C cytokiner, hvor X er en aminosyre. Dermed må in vivo immunceller reagere hensiktsmessig på svært komplekse romlige og temporale signaler, noe som gjør studiet av chemotaxis til en skremmende oppgave. Nedenfor gir vi en kort historie med chemotaxis, som begynte med intravitale bildemetoder.
Studien av leukocytter chemotaxis dateres tilbake til 188812, da øyelege Theodorologist Karl Gustav Leber tydelig beskrev den rettede migrasjonen av leukocytter til, og akkumulering på, steder av betennelse i en modell av mykotisk (sopp) keratitt. Leber understreket at tiltrekningen av overflødige leukocytter av patogene stoffer er viktig for eliminering av skadelige mikroorganismer via fagocytose, som hadde blitt beskrevet av Metchnikoff (også kjent som Metschnikoff) tidligere i samme tiår13. In vivo eksperimenter ble også utført på 1920-tallet av Clark og Clark14,15, som utnyttet gjennomsiktigheten av rumpetroll og viste at steril betennelse indusert av croton olje14 eller andre irriterende15 forårsaket leukocytter å holde seg til blodkar, etterfulgt av diapdesis (transendothelial migrasjon) og rask migrasjon gjennom vevsområdene mot itantrri. I vitro eksperimenter ved hjelp av mikrocinematografi metoden utviklet av Jean Comandon16 viste at leukocytter migrerte mot en partikkelkjemoattractant kilde som bakterier17. På den tiden var de molekylære identitetene til kjemotaktiske faktorer ukjente. På 1960-tallet innså Stephen Boyden18 at teknikker for å studere kjemotaktisk aktivitet av løselige stoffer manglet. Han utviklet et kammer, senere kjent som Boyden-kammeret, med to rom adskilt av en filterpapirmembran. En cellesuspensjon legges til det øvre rommet, og teststoffet legges til enten begge rommene eller bare i det nedre rommet. Etter en inkubasjonsperiode fjernes filtermembranen, og cellene er faste og farget. Ved å sammenligne hvor mange celler som migrerer over filtermembranen mot den nedre brønnen med teststoffet i begge rom, i verken rom, eller bare i det nedre rommet, kan kjemotaktisk aktivitet bestemmes. Transwell analyser er fortsatt populære i dag og har blitt endret på ulike måter, inkludert bruk av forskjellige polykarbonatmembraner med definerte porestørrelser og tettheter19,20. En stor ulempe med Transwell-analyser er at det er upraktisk å visualisere celler som migrerer direkte, og migrasjonsbanen over membranen overstiger vanligvis ikke diameteren på en immuncelle.
Sally H. Zigmond utviklet et chemotaxis kammer21 som gjorde det mulig å visualisere både gradientdannelse og cellemorfologi ved hjelp av fluorescerende fargestoffer. Kammeret består av en plexiglass (akryl) lysbilde med to parallelle lineære brønner, hver med et volum på ~ 100 μL, atskilt med en 1 mm bred bro 3-10 μm under det øvre planet av lysbildet. En coverslip seeded med celler er invertert og plassert på lysbildet slik at den strekker seg over de to brønnene. Etter tillegg av et kjemoattractant til en av brønnene, dannes en bratt kjemoattractant gradient over broen, vanligvis innen 30–90 min. Humane polymoromukukytter (granulocytter) i Zigmond-kammeret observeres orientere seg mot kjemoattractant. Variasjoner av Zigmond-kammeret er rapportert, inkludert Dunn22 og Insall23 kamre, som begge bruker en coverslip seeded med celler plassert over to brønner atskilt med en 1 mm bred bro. Dunn-kammeret består av konsentriske brønner adskilt av en sirkulær bro, mens Insall-kammeret er tettere knyttet til Zigmond-kammeret, men gir broer med to forskjellige bredder, 0, 5 mm og 1 mm. En ny chemotaxis kammer, kalt μ-Slide Chemotaxis og produsert av plast injeksjon molding, ble beskrevet av Zemgel et al.24. Chemotaxis kammeret består av to 40 μL reservoarer atskilt med en 1 mm bred kanal med en lengde på 2 mm og en høyde på 70 μm. Bunnen av kammeret er dannet av en gassgjennomtrengelig, tynn plastark med samme tykkelse og optiske egenskaper av en Nr. 1,5 glass coverslip24. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjelp av μ-Slide Chemotaxis kammeret for å visualisere migrering av mus bosatt peritoneal makrofager for opptil 14 timer i en kjemotaktisk (komplement C5a) gradient.
Intravital imaging dateres tilbake til 1800-tallet og gir et middel til å studere oppførselen til levende immunceller i sitt naturlige miljø. Men selv med dagens avanserte mikroskopi og genetiske teknikker er det vanskelig å studere responsen fra celler til spesifikke kjemoattractants in vivo. For å omgå dette problemet, utviklet Boyden18 Transwell-analyser på 1960-tallet, men disse endepunktanalysene ga ikke visualisering av hvordan celler faktisk migrerte mot kjemoattractants, noe som gjør det vanskelig å skille chemokinesis, stimulert tilfeldig migrasjon av et kjemisk signal32, og chemotaxis, migrasjon mot høyere konsentrasjoner av kjemiske stimuli fra hverandre33. Dette problemet ble løst ved å designe ulike åpne kamre med en bro, vanligvis 1 mm bred, som ligger mellom to reservoarer og tilgjengelig med en objektiv linse21,,22,23. Påføring av en omvendt dekselslip, seeded med tilhengerceller, lukker kamrene og kjemoattractant lagt til et av reservoarene diffuserover broen til det motsatte reservoaret, og skaper en konsentrasjonsgradient. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjelp av samme prinsipp, men ved hjelp av et lukket kammer med fire fylleporter. Ved hjelp av dette systemet og tidsforløp, fasekontrastmikroskopi, utviklet vi en analyse til bilde mus bosatt peritoneale makrofager migrerer i en kjemotaktisk komplement C5a gradient31,,34,35,36. Denne analysen, kombinert med knockout musemodeller, viste seg medvirkende i undersøkelsen av rollene til ulike Rho GTPases og motorproteiner i makrofag morfologi, motilitet, og chemotaxis31,34,35,36,37. Vi har også brukt denne tilnærmingen til å bilde menneskelige perifere blod monocytter migrere på en 2D overflate eller i en 3D kollagen type Jeg matrise38. Videre er analysen egnet for mus benmarg-avledet makrofager eller makrofager avledet fra betinget udødeliggjort myelogen forløperceller39,40. Vi har tidligere brukt polytetrafluoretylen (PTFE) poser med luer adaptere til kultur benmargsceller og få makrofager34. Fordelen med PTFE poser er at cellene lett kan resuspenderes og klar til bruk etter å ha plassert posen på is i 20-30 min. Merk at vi forutfyller chemotaxis lysbildeobservasjonsområdet før vi introduserer cellene. Denne tilnærmingen har fordelen at uønskede luftbobler senere kan skylles ut (med variabel suksess) og det forhåndsfuktede observasjonsområdet muliggjør langsom innføring av en cellesuspensjon ved pipettering. Forhåndspåfylling øker imidlertid sannsynligheten for at mediet delvis vil strømme inn i ett eller begge de flankerte reservoarene, noe som vil fremme såing av celler utenfor observasjonsområdet. Alternativt kan cellesuspensjonen bli direkte pipetted inn i et tørt observasjonsområde, men uønskede luftbobler kan ikke senere utvises.
Bukhulen i musen inneholder to hovedpopulasjoner av celler: F4/80+ makrofager og (mindre) CD19+ B-celler, med et forhold på ca. 1:2 (Figur 4A). Disse to cellepopulasjonene står for over 95% av peritoneale hulromceller, mens de gjenværende F4/80–/ CD19– cellene vanligvis kan identifiseres som CD11c+ celler (dendrittiske celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svakt tilhengerk.h.-celler vaskes ut av observasjonsområdet under fylling av reservoarene med mediet (Figur 2). Etter å ha lagt til kjemoattractant til ett av de to reservoarene, kan tidsforløp, fasekontrastmikroskopi brukes til å bilde de gjenværende cellene (makrofager) som migrerer i en utviklende kjemoattractantgradient. Dannelsen av komplementet C5a gradient i observasjonsområdet, via diffusjon fra ett reservoar til det andre, kan simuleres ved hjelp av et fluorescerende farge med lignende molekylvekt. En god erstatning for rekombinant mus supplement C5a (spådd molekylvekt, 9,0 kDa) er fluorescerende merket dextran (10 kDa)31. Ved hjelp av konfokal mikroskopi kan fluorescensgradienten i den smale kanalen (observasjonsområdet) som forbinder de to reservoarene i chemotaxis-lysbildet måles med faste intervaller og konsentrasjonsprofiler på de forskjellige tidspunktene plottes24,31. Vi legger rutinemessig til en nonfluorescerende, blå farge (Patent Blue V) til kjemoattractant medium for å gi en praktisk visuell indikator på diffusjon og gradient formasjon. Innen 1 time etter innføring av 15 μL blå, kjemoattractantholdig medium i et reservoar, ser reservoaret jevnt blått ut, og i henhold til Ficks diffusjonslover vil en gradient dannes over det smale observasjonsområdet som forbinder reservoarene (figur 3B). Flere dager er nødvendig for at solute (blå farge eller kjemoattractant) skal bli jevnt fordelt.
Fluorescensmikroskopi kan erstattes med mikroskopi med fasekontrast, noe som gir fordeler for automatisert cellesporing, fordi fluorescerende merkede celler lett kan skilles fra bakgrunnen. En annen fordel er at spesifikke populasjoner av immunceller kan spores selektivt etter merking av overflatemarkører med fluorescerende antistoffer. Vi brukte denne tilnærmingen til bilde menneskelig perifert blod CD14+ celler (monocytter) migrerer i en kjemotaktisk fMLP (N-formylmethionine-leucyl-fenyl-fenylalanin) gradient38. På samme måte kan fluorescerende anti-F4/80 antistoffer brukes til å bilde musmakrofager som migrerer i en kjemotaktisk komplement C5a gradient. Fototoksisitet er en potensiell ulempe ved bruk av fluorescensavbildning41. Dette kan reduseres med ulike måter42, inkludert bruk av fluoroforer begeistret med lengre bølgelengder og legge antioksidanter til mediet. Alternativt kan merkede celler i utgangspunktet identifiseres ved fluorescensmikroskopi og deretter avbildet av tidsforløp, fasekontrastmikroskopi. Men i praksis kan celler som beveger seg ved moderat lave hastigheter, for eksempel ~ 1 μm / min (makrofager) eller ~ 4 μm / min (monocytter), periodisk avbildet av fluorescensmikroskopi med intervaller på minutter, som tolereres godt38. Vi har tidligere brukt fluorescensmikroskopi og chemotaxis lysbildet beskrevet her for 3D chemotaxis analyser38,43. I dette tilfellet ble begge reservoarene forhåndsfylt med middels og 15 μL kjemoattractantholdig medium trukket inn i et av reservoarene umiddelbart før langsomt pipettering fluorescerende merkede celler suspendert i medium som inneholder kollagen type I inn i observasjonsområdet. Den vanskelige delen av denne prosedyren er håndteringen av kollagen type I, som er konsentrert i sur løsning. PH av kollagen løsningen må nøytraliseres ved tillegg av alkalisk løsning før du blander den iskalde kollagenløsningen med cellesuspensjonen. Overføring av kollagencelleblandingen til en inkubator ved 37 °C vil initiere kollagenpolymerisering. Under inkubasjon bør lysbildet sakte roteres rundt sin lange akse slik at cellene forblir jevnt fordelt i X-, Y- og Z-aksen retninger mens kollagen polymeriserer seg til en gel. En relatert lukket chemotaxis lysbilde egnet for 3D chemotaxis analyser, med seks plugger i stedet for fire plugger, har nylig blitt beskrevet29. Dette systemet gjør at kollagencelleblandingen kan innføres i observasjonsområdet før de uavhengig fyller hvert av de flankerte reservoarene, fordi hvert reservoar har to fylleporter, i stedet for en enkelt port.
Oppsummert beskriver vi en sanntids chemotaxis analyse som gjør det mulig å visualisere celler navigere i en kjemotaktisk gradient over en periode på 6 eller flere timer. Her fokuserer vi på makrofager, som spiller store roller i inflammatoriske sykdommer, men har vært underrepresentert i sanntid chemotaxis analyser sammenlignet med raskere bevegelige celler som nøytrofiler og Dictyostelium amoebae.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend (HA 3271/3-2) fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |