Wachstum von Human- und Schafhornhaut-Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte, die erforderlich sind, um hornhaut-Endothelzellkulturen aus Expflanzen von menschlichem oder Schafgewebe zu etablieren und zu züchten. Ein Verfahren zur Subkulierung von kornealen Endothelzellen auf membranösen Biomaterialien wird ebenfalls vorgestellt.

Abstract

Hornhaut-Endothel-Zellkulturen neigen dazu, nach Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts epitheliale inmechymale Übergänge (EMT) zu durchlaufen. EMT ist schädlich für die Zellen, da es ihre Fähigkeit reduziert, eine reife und funktionelle Schicht zu bilden. Hier stellen wir eine Methode zur Etablierung und Subkultivierung von kornealen Endothelzellkulturen von Mensch und Schaf vor, die den Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts minimiert. Explantieren der Hornhaut-Endothel/Descemet-Membran werden aus Spenderhornhäuten entnommen und unter Bedingungen in die Gewebekultur gebracht, die es den Zellen ermöglichen, kollektiv auf die Kulturoberfläche zu wandern. Sobald eine Kultur etabliert ist, werden die Explants auf frische Platten übertragen, um neue Kulturen zu initiieren. Dispase II wird verwendet, um Zellklumpen sanft von Gewebekulturplatten zur Subkultivierung zu heben. Mit diesem Protokoll hergestellte Hornhaut-Endothelzellkulturen eignen sich für die Übertragung auf Biomaterialmembranen zur Herstellung von gewebetechnischen Zellschichten für die Transplantation in Tierversuchen. Ein maßgeschneidertes Gerät zur Unterstützung von Biomaterialmembranen während der Gewebekultur wird beschrieben und ein Beispiel für ein gewebetechnisches Transplantat, das aus einer Schicht aus hornförmigen Endothelzellen und einer Schicht von hornförmigen Stromalzellen auf beiden Seiten einer Kollagenmembran Typ I besteht, wird vorgestellt.

Introduction

Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe, das sich an der Vorderseite des Auges befindet. Es besteht aus drei Hauptschichten: einer Epithelschicht auf der außenoberfläche, einer mittleren Stroma-Schicht und einer inneren Schicht, dem Hornhautendothel. Das Hornhautendothel ist eine Monoschicht von Zellen, die auf einer Kellermembran namens Descemet-Membran sitzt und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält, indem es die Flüssigkeitsmenge reguliert, die aus dem zugrunde liegenden wässrigen Humor in die Stroma eindringt. Zu viel Flüssigkeit im Stroma verursacht Hornhautschwellungen, Opazität und Sehverlust. Das Endothel ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der Sehkraft.

Das Hornhautendothel kann aus einer Reihe von Gründen wie Alterung, Krankheit und Verletzungen dysfunktional werden, und die einzige aktuelle Behandlung ist Transplantationschirurgie. Während dieser Operation wird das Endothel und die Descemet-Membran aus der Hornhaut des Patienten entfernt und durch ein Transplantat von Endothel und Descemets Membran aus einer Spenderhornhaut ersetzt. Viele Endotheltransplantate enthalten auch eine dünne Schicht Stromalgewebe, um die Handhabung und Befestigung an der Wirtshornhaut¹zu unterstützen.

Weltweit ist die Nachfrage nach Hornhautspendergewebe für Transplantationsoperationen größer als die Menge, die von Augenbänken 2 geliefert werden^kann. Es gab daher einen Antrieb, gewebegefertigte Hornhaut-Endothel-Transplantationen zu entwickeln, die verwendet werden könnten, um diesen Mangel zu lindern³. Die Begründung dafür beruht auf der Tatsache, dass Endothel aus einer einzelnen Hornhaut derzeit nur auf einen einzelnen Patienten übertragen werden kann, wenn die Hornhautendothelzellen jedoch zuerst erweitert und auf biomaterialgerüsten in der Gewebekultur angebaut werden, sie zur Behandlung mehrerer Patienten verwendet werden könnten.

Zu den großen Herausforderungen, die angegangen werden müssen, bevor gewebetechnische Hornhaut-Endotheltransplantationen für Chirurgen zu einer praktikablen Option werden, gehören: (1) Etablierung von Techniken zur Erweiterung von Hornhaut-Endothelzellen von hoher Qualität und zur Herstellung von reifen und funktionelle horneale Endothelzellschichten in vitro und (2) Die Herstellung von Techniken zum Anbau der Zellen auf biomaterialgerüsten, um gewebetechnische Transplantate herzustellen, die den derzeit verwendeten Transplantaten aus der Spenderhornhaut entsprechen oder besser sind.

Hornhaut-Endothelzellen haben ein sehr geringes proliferatives Potenzial in vivo, können aber stimuliert werden, um sich in vitro zu teilen⁴. Dennoch neigen sie stark dazu, sich einem in vitro epitheliaal-mesenchymalen Übergang (EMT) zu unterziehen, was ihre Fähigkeit zur Bildung einer reifen, funktionellen Endothelschicht verringert. Bekannte Auslöser für EMT in hornförmigen Endothelzellen sind die Exposition gegenüber bestimmten Wachstumsfaktoren und der Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts⁵. Es ist daher fast unvermeidlich, dass horneale Endothelzellkulturen, die während der Subkultur enzymatisch dissoziiert werden, Veränderungen im Zusammenhang mit EMT erfahren werden. Hier stellen wir eine Zellkulturmethode für humane oder Schafe Hornhaut-Endothelzellen vor, die entwickelt wurde, um Störungen von Zell-zu-Zell-Kontakten während Isolations-, Expansions- und Subkulturphasen zu minimieren, um das Potenzial für EMT zu reduzieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie gewebegefertigte Transplantate, die den Membran-/Stromalgewebetransplantaten von Spenderhornhaut/Descemet ähneln, durch den Anbau von kultivierten Zellschichten auf beiden Seiten einer Biomaterialmembran in einem kundenspezifischen Montagegerät hergestellt werden können.

Protocol

Humaneas mit Spenderzustimmung für die Forschung wurden von der Queensland Eye Bank bezogen und mit ethischer Genehmigung von der Human Research Ethics Committee des Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048) verwendet. Schafhornhäuten wurden von eingeschläferten Tieren in der Herston Medical Research Facility der University of Queensland im Rahmen einer Vereinbarung über die GemeinsameNutzung von Geweben gewonnen. 1. Vorbereitung von Sezierwerkzeugen Sterilisiere…

Representative Results

Die Methode zur Isolierung und Erweiterung von hornhauten Endothelzellen aus menschlichen oder Schafhornhäuten ist in Abbildung 1 und Abbildung 2zusammengefasst. Die meisten Expflanzen, die aus den Hornhäuten von 1 bis 2 Jahre alten Schafen oder menschlichen Spendern mit weniger als 30 Jahren gewonnen werden, werden innerhalb einer Woche an Attachment Factor-beschichteten Gewebekulturplatten befestigt, es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass bis zu einem Dritt…

Discussion

Eine bedeutende technische Herausforderung, die mit der Etablierung und Erweiterung menschlicher Hornhaut-Endothelzellen verbunden ist, verhindert, dass EMT in den Kulturen auftritt. EMT kann in hornförmigen Endothelzellen durch Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts ausgelöst werden, aber die meisten Zellkulturprotokolle für diese Zellen beinhalten enzymatische Dissoziation zu einzelnen Zellen während der Isolation und Subkultur¹⁰. Hier stellen wir ein alternatives Zellkulturprotokoll für horneal…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.