Detta protokoll beskriver kliniskt genomförbar beredning av högkvalitativa PBMC och plasma biosamples vid den kliniska prövning webbplats som kan användas för translationell biomarkör analys.
Analys av biomarkörer i perifert blod blir allt viktigare i kliniska prövningar för att fastställa bevis på mekanism för att utvärdera effekter av behandling, och hjälpa till att vägleda dos och schema inställning av terapier. Från en enda bloddragning kan perifera blodmonukleära celler isoleras och bearbetas för att analysera och kvantifiera proteinmarkörer, och plasmaprover kan användas för analys av cirkulerande tumör-DNA, cytokiner och plasmametabolomik. Longitudinella prover från en behandling ger information om utvecklingen av en given protein markör, mutationsstatus och immunologiska landskap av patienten. Detta kan endast uppnås om bearbetningen av perifert blod utförs effektivt på kliniska platser och proverna bevaras ordentligt från säng till bänk. Här presenterar vi ett optimerat allmänt protokoll som kan implementeras på kliniska platser för att erhålla PBMC-pellets och plasmaprover i kliniska multicenterförsök, som kommer att göra det möjligt för kliniska proffs i sjukhuslaboratorier att framgångsrikt tillhandahålla högkvalitativa prover, oavsett deras tekniska expertis. Alternativa protokollvariationer presenteras också som är optimerade för mer specifika analysmetoder nedströms. Vi tillämpar detta protokoll för att studera proteinbiomarkörer mot DNA-svar (DDR) på röntgenbestrålat blod för att visa lämpligheten av tillvägagångssättet i onkologiinställningar där DDR-läkemedel och/ eller strålbehandling har praktiserats samt i prekliniska stadier där mekanistisk hypotestestning krävs.
Läkemedelsutveckling syftar till att leverera nya terapier som tillgodoser icke tillgodosedda medicinska behov och mer riktad, personlig medicin. Flera läkemedelsmekanismer är under aktiv undersökning inklusive enzymatisk hämning såsom kinas1,proteas2, eller poly (ADP-ribose) polymeras (PARP) hämmare3,proteinnedbrytare4, terapeutiska antikroppar5, och antikroppskonjugerade läkemedel (ADC)6, bland många andra. Ett exempel på ansträngningarna att få bättre behandlingar inom onkologi är användningen av kinashämmare med målet att stoppa signalkaskaderna som håller cancercellerna prolifererande1,7. Att mäta de nivåer av substratfosforylering som är specifika för dessa kinaser är den bästa farmakodynamiska biomarkören för att kvantifiera verkningsmekanismen hos dessa hämmare8. Andra läkemedel kan modulera uttrycket av ett visst protein, och i så fall är det av största vikt att kunna kvantifiera förändringarna i koncentrationen av deras målprotein längsgående under behandlingens gång. Oberoende av egenskaperna hos ett läkemedel eller en patologi är därför utvärdering av biomarkörer för att fastställa farmakokinetik (PK)/ farmakodynamik (PD) förhållandet mellan läkemedelsexponering och målmodulering den bästa praxisen i tidig klinisk utveckling och möjliggör bestämning av en säker och tolererad farmakologiskt aktiv dos / schema9.
Medan i onkologi klinisk utveckling, biomarkör analys i tarmbiopsier kan vara den bästa inställningen för att fastställa bevis på mekanismen för ett läkemedel, antalet tillgängliga tarmbiopsier i en studie är vanligtvis ganskabegränsad 10,11. Alternativt är perifera blodprover mycket värdefulla för kliniska prövningar eftersom de involverar ett minimalt invasivt förfarande, är snabba och lätta att få underlätta longitudinell analys, är billigare än tarmbiopsier och ger omfattande information för realtidsövervakning av resultatet av en behandling. En ytterligare fördel med att bedöma PD-biomarkörer i perifert blod är förmågan att använda biosamplet för att även kvantifiera PK vilket möjliggör exakthet vid bestämning av PK/PD kvantitativa relationer och efterföljande PK/PD-modellering12,13. Perifera mononukleära celler i perifert blod (PBMCs) från helblod kan isoleras för att studera proteinmarkörer, som antingen upplever förändringar i uttrycksnivån eller i deras postöversättningsändringar. Dessutom kan PBMCs användas för immunophenotypingändamål 14,15, immun funktionalitet analyser såsom bedömning av antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC)16 och epigenetisk analys genom RNA isolering. På samma sätt kan plasma från helblod användas för att kvantifiera cytokiner för att karakterisera en patients immunologiska svar, för att utföra metaboliska studier och även för att isolera och sekvensera cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) för övervakning av klonurvalet av sjukdom under urval från det terapeutiska medlet, vilket ofta ger en mekanistisk grund för behandlingsresistens17,18,19 möjliggör utveckling av efterföljande generationer av terapeutiska20. Slutligen möjliggör isolering av cirkulerande tumörceller (CTC) från perifert blod utvärdering av sjukdomsprogression genom longitudinell uppräkning, DNA/RNA-sekvensering och protein-biomarköranalys21. Även om denna isolering är kompatibel med protokollet som beskrivshäri 22, gör det låga överflöd av CTC i många cancertyper och tidiga stadier av sjukdomen användningen av specialiserade rör mer lämpliga för att minimera CTC-nedbrytning23.
Under de senaste åren har användningen av flytande tarmbiopsier förbättrat informationen som erhållits i kliniska prövningar och PBMC-samlingar har inkluderats i många studier för att övervaka målengagemang och bevis på mekanism antingen direkt i tumörceller för vissa typer av hematologiska maligniteter, eller på PBMCs själva som PD-surrogater avtumörceller 24,25,26. Beredningen av högkvalitativa prover påverkar positivt avgörandet av den säkraste och mest effektiva behandlingen för en viss patologi, men enligt vår erfarenhet har kvaliteten på PBMC-preparat som erhållits från olika kliniska platser utsatts för stor variation i kvalitet vilket resulterar i prover som inte är lämpliga för analys nedströms. Detta har påverkat mängden PD-data som skulle kunna samlas in från dessa studier.
Här beskriver vi i detalj ett lätt att följa protokoll som visar hur man effektivt isolerar både PBMCs och plasmaprover från en enda bloddragning i en klinisk miljö. Protokollet är baserat på instruktionerna från tillverkaren av de mononukleära cellberedningsrören, som innehåller modifieringar där verklig erfarenhet har belyst svårigheter i protokollutförandet som rapporterats av kliniska platser, såsom centrifugationsproblem, bearbetningsfördröjningar och provöverföring till kryovials. Det finns alternativa kommersiellt tillgängliga metoder för användning av mononukleära cellberedningsrör baserade på densitetsgradientseparation med polysackaridlösningar med eller utan en barriär som skiljer lösningen från blodet27. Om den relevanta kliniska platsen redan är väl erfaren i dessa alternativa metoder, detta protokoll kan accepteras ersätta med dessa. I sådana fall kan två faktorer beaktas: vissa alternativa metoder kräver överföring av helblod från ett uppsamlingsrör till ett separat beredningsrör där en ytterligare överföring av humant primärbiologiskt material kan utgöra en något ökad säkerhetsrisk, och framgången för metoder utan hinder som skiljer blodet från polysackaridlösningen förlitar sig på kritiska steg som att skikta blodprovet på det densitetsgradientmedium som kräver utveckling av en förfinad teknisk expertis som inte alltid finns i en laboratoriemiljö på sjukhus. Trots ovanstående punkter är den totala lönsamheten och cellåtervinningen jämförbara mellan dessa tekniker15,28. Valet av metodik är därför något beroende av tidigare teknisk erfarenhet, men i våra händer kan mononukleära cellberedningsrör användas framgångsrikt i ett brett kliniskt sammanhang och är annars vår rekommendation.
Medan en slutpunkt i detta protokoll är att producera PBMC pellets för vidare bearbetning till lysater, kan andra slutliga tillämpningar av PBMC-samlingen genomföras, såsom isolering av nukleinsyror, eller produktion av PBMC-fläckar eller PBMC-block lämpliga för immunohistokemi (IHC) metoder. Viktigt, eftersom varje biosampel som tas från patienter representerar ett invasivt förfarande på åtminstone en viss nivå, maximerar detta protokoll det användbara materialet från varje prov genom att också isolera plasma som kan användas för cytokinanalyser, metabolomiska studier eller ctDNA-sekvensering.
Analysen av perifera biomarkörer i onkologiförsök är en av de många applikationerna av PBMC lysates. Ett exempel är utvärderingen av DNA-skaderesponsen (DDR) i behandlingar som kemoterapi, strålbehandling eller användning av hämmare av enzymer som är involverade iDDR,såsom fosfatidylinositol-3 kinasrelaterade kinaser (PIKKs)7 och PARPs3,13. Syftet med dessa behandlingar är att öka DNA-skadorna i prolifererande celler, vilket genererar hög toxicitet i celler med nedsatta DDR-mekanismer och cellcykelkontroller, såsom cancerceller. Här presenterar vi ett exempel med en studie av DDR-biomarkörer i perifert blod som utsätts för röntgenstrålar.
Högkvalitativa preparat av PBMCs och plasma som kan beredas robust och reproducerbart vid kliniska prövningsplatser är ovärderliga för att informera kliniska prövningar perifera prediktiva och farmakodynamiska translationella biomarkör endpoints. Här har vi tillhandahållit ett kort, tydligt protokoll som tar itu med de typiskt problematiska stegen som hittills har varit sårbara för avrättningsfel i en klinisk prövningsinställning. Protokollet kan dock optimeras ytterligare för att uppfylla specifika krav, till exempel tidsbegränsningar på den kliniska platsen eller typ av nedströmsanalyser (se Kompletterande fil).
I detta syfte har vi visat hur man isolerar både PBMCs och plasma från helblod med hjälp av mononukleära cellberedningsrör för att producera frysta PBMC-pellets och fryst plasma som är lämpliga för en mängd olika nedströmsanalyser. Vi har uppmärksammat särskilt kritiska protokollsteg som inbegriper centrifugering och identifiering av PBMC-skiktet i steg 2.5 och PBMC-pellets i steg 3.3 och 3.6. Historiskt sett, där kliniska platser ofta har gått fel är att ställa in centrifugen till rätt enheter (förvirra ett RCF- eller x g-värde med ett RPM-värde), vilket fördröjer bearbetningen av blodprover, temperatur och närvaron av stora volymer PBS ovanför den frysta cellpelleten. I de flesta centrifugering kommer rotorer felaktigt att ange ett x g-värde som en RPM-inställning resultera i betydande undercentrifugering med ett resulterande dåligt definierat eller frånvarande PBMC-skikt och potentiellt oavsiktlig PBMC-kassering under tvättsteg på grund av ineffektiv cellpellets. Det finns dock en möjlighet att ett PBMC-skikt inte är synligt trots att man använder rätt centrifugationsinställningar och rotoradapter om patienten har utvecklat leukopeni. Detta tillstånd kan påverka patienter som är inskrivna i onkologiförsök på grund av kemoterapi eller strålbehandling och bör övervägas. En annan kritisk punkt som har klargjorts i protokollet är att prover måste bearbetas inom 1-2 h från bloddragningen för att minska risken för hemolys negativt påverka protokollet. Dessutom minskar risken för att ta prover under den första timmen av blodprovet ex vivovariation, vilket kan ha stor inverkan på avläsningar av farmakokinetik och på biomarkörer som påverkas av blodbevarande eller aktiva signalvägar, såsom det fall som visas i figur 4. Förseningar i provbehandlingen kan också ha en skadlig effekt på cellens livskraft om cellerna ska kryopreserveras34. En annan faktor som kan påverka både utbytet och föroreningen av röda blodkroppar är lagrings- och centrifugationstemperaturen, som bör hållas vid rumstemperatur (18-25 °C). Lägre temperaturer ökar densiteten hos densitetsgradientmediet, vilket resulterar i en högre grad av röd blodcells- och granulocytförorening eftersom dessa celler inte aggregerar också. Å andra sidan leder högre temperaturer till PBMCs fångade mellan aggregerade erytrocyter, vilket minskar utbytet avpreparatet 15,27,28. Och slutligen är det viktigt att högst 50-100 μL vätska finns med cellpelleten i kryovialen, eftersom detta negativt påverkar koncentrationen av eventuella proteinlysater som erhålls vid nedströms bearbetning av dessa PBMC-preparat. Ett överskott av vätska kommer att överdilera prover, vilket leder till lysater med mycket låg proteinkoncentration som inte är lämplig för biomarköranalys. Dessutom kommer bevarandet av eventuella ändringar efter översättningen att försämras, och lysens effektivitet kommer också att minskas avsevärt.
Mononukleära cellberedningsrör valdes eftersom de erbjuder det enklaste sättet att isolera både PBMCs och plasma i en enda bloddragning för kliniska prövningar med, enligt vår erfarenhet, utmärkt reproducerbarhet. Blodbehandlingen kräver inte högutbildade operatörer, och användningen av ett enda rör avlägsnar behovet av att späda ut blodet och dess överföring till ett annat rör, vilket minskar farorisken. förkortar protokollet på grund av att centrifugeringsstegen med bromsarna på. och alla reagenser finns i röret, vilket minskar variationen. Enligt vår erfarenhet uppväger dessa fördelar den högre kostnaden för dessa rör jämfört med andra klassiska metoder som endast omfattar användning av en densitetsgradientseparation medium27,28 (£ 410 per 60 enheter medan lymfoprep medium för 66 50-ml preparat är £ 215). De finns i två typer av antikoagulantia, heparin och citrat, som båda är jämförbara med att upprätthålla funktionaliteten hos de isolerade PBMCs35, därför kommer valet av ett antikoagulantia över det andra att baseras på eventuell påverkan av heparin eller citrat i nedströmsmarkörstudierna. Även om det har visats att EDTA-rör ger det högsta PBMC-isoleringsutbytet jämfört med heparin eller citrat13, är fördelen med enkel användning av manipuleringen av endast ett rör denna hänsyn. Om cytokiner ska analyseras kan antikoagulantia ha en effekt av de nivåer som detekteras i plasma, därför bör båda antikoagulantia testas innan de väljs ut för den kliniskaprövningen 36. Om plasman ska användas för metabolomikstudier, skulle heparin som antikoagulantia föredras37. Därför är den enda punkt som lämnas till slutanvändaren eller översättningsforskaren för kliniska prövningar huruvida citrat eller heparin kommer att vara lämpligare för deras ändamål när kostnaderna har bedömts.
Medan fördelarna med att använda cellberedningsrör är många jämfört med de begränsningar de utgör (högre kostnad och tillgänglighet för ett begränsat utbud av antikoagulantia), kan den huvudsakliga begränsningen av användningen av PBMCs eller plasma för att erhålla PD-biomarkörer i kliniska prövningar, särskilt i onkologi, vara orelaterad till isoleringsmetoden. Med undantag för hematologiska cancerformer, där tumör tas direkt från perifert blod, för andra cancerindikationer är plasma och PBMCs surrogatvävnader som inte nödvändigtvis efterliknar den primära tumören. Perifer vävnad får inte dela genomet och epigenomet med den primära tumören, därför är perifer analys av biomarkörer beroende av en specifik tumörmutation huvudsakligen begränsad till ctDNA-analys (från plasma) eller CTC (genom efterföljande sortering av PBMC-skiktet). Dessutom kan signalering kaskader köra eller bidra till tumör spridning kanske inte vara lika aktiv i perifert blod. Denna utmaning kan övervinnas genom att tillämpa biomarkörupptäcktsmetoder riktade motblod 8 för att identifiera alternativa biomarkörer eller koppling ex vivo behandlingar på isolering av plasma38 och PBMCpreparat 26.
I det nuvarande protokollet kan frysta PBMC-pellets enkelt bearbetas utanför den kliniska platsen för att ge proteinlysat som kan utvärderas med västerländsk blotting eller ELISA-tekniker. Alternativa metoder för att använda PBMCs för att möjliggöra IHC-metoder har också presenterats(kompletterande fil). Dessutom har vi också specificerat möjligheten att cryopreserving PBMCs (se Kompletterande fil)för immuncellsövervakning, en relevant applikation inom onkologi, med immun checkpoint-hämmare och ADCs som alltmer testas i kliniska prövningar. Bedömningen av immunfunktioner som ADCC16 och immunophenotyping är applikationer som är kompatibla med kryopreserverade PBMCs isolerade från mononukleära cellberedningsrör15. Det finns en varning om kryopreservation, eftersom det kan främja nedreglering av vissa yt- och interna markörer och kan försämra vissa cellfunktioner, men PBMC kryopreservation är det enda möjliga sättet att utföra dessa analyser på grund av tidsbegränsningar vid hantering av prover från flera kliniska platser till bearbetningen i externalaboratorier 14,15, och dessa skadliga effekter kan övervinnas kraftigt genom bra upptiningsmetoder och viloperioder39.
Sammanfattningsvis kommer protokollet som tillhandahålls här att möjliggöra tillförlitlig beredning av PBMCs och plasmaprover i alla kliniska institutioner med gemensam utrustning och material så att translationella effektmått från perifert blod kan aktiveras på ett robust sätt i globala kliniska prövningar.
Slutligen visar vi hur analysen av PBMC-lysater mekanistiskt kan informera svaret på DNA-skadliga medel genom att visa en dosberoende postöversättningsmodifiering av viktiga DDR-faktorer, som kan användas för att forma klinisk utveckling. Framåtblickande, implementering av metoder som är mer kvantitativa än western blotting (t.ex. masspektrometri40) och kräver mindre insatsmaterial (t.ex. kapillär western blotting och ELISA) skulle bidra till att föra dessa prekliniska resultat mot en mer robust och systematisk utvärdering av PBMC-patientprover.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla medlemmar i Translational Medicine vid AstraZeneca Oncology Research and Early Development för deras feedback på protokollet, särskilt Hedley Carr, Tammie Yeh och Nathan Standifer för råd om plasmapreparat för ctDNA-analys, om PBMC-isolering respektive PBMC-kryopreservation respektive immunofenotypning.
1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |