형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화
Summary
우리는 미세 유체 장치에서 단일 거대 분자를 고정시키고 전단 흐름하에서 적합성의 변화를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유동 환경에서 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자의 생체 역학 적 및 기능적 특성을 특성화하는 데 유용합니다.
Abstract
기계적 섭동 하에서 단일 분자 거동은 많은 생물학적 과정을 이해하는 것이 널리 특징지어졌다. 그러나, 원자력 현미경 검사법과 같은 방법은 시간적 분해능이 제한되어 있는 반면, Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 적합성만 유추할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 각종 교류 조건에 있는 단 하나 분자의 situ 가시화에서 실시간 허용합니다. 우리의 프로토콜은 형광 현미경 검사법을 사용하여 다른 전단 흐름 환경에서 단일 생체 분자의 형태 변화를 포착하는 단계를 설명합니다. 전단 흐름은 미세 유체 채널 내부에서 생성되며 주사기 펌프에 의해 제어됩니다. 방법의 데모로, 폰 윌레브란트 인자 (VWF) 및 람다 DNA는 비오틴과 플루오로포어로 표지된 다음 채널 표면에 고정됩니다. 이들의 적합성은 총 내부 반사(TIRF) 및 공초점 형광 현미경 을 사용하여 가변 전단 흐름 하에서 지속적으로 모니터링됩니다. VWF의 가역적 해명 역학은 그 기능이 인간의 혈액에서 어떻게 조절되는지 이해하는 데 유용하며 람다 DNA의 형태는 거대 분자의 생물 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 폴리머, 특히 생체 고분자의 거동을 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.
Introduction
생체 분자가 환경 자극에 반응하는 방식의 메커니즘은 널리 연구되었습니다. 특히 유동 환경에서 전단 및 연신력은 형태 변화와 잠재적으로 생체 분자의 기능을 조절합니다. 대표적인 예로는 람다 DNA 및 폰 윌레브란트 인자(VWF)의 전단 유도 해명이 있다. 람다 DNA는 개별, 유연한 폴리머 사슬의 형태 역학 및 폴리머 용액1,2,3,4의변성학을 이해하는 도구로 사용되어 왔다. VWF는 비정상적인 전단 속도 및 흐름 패턴으로 혈관의 상처 부위에 혈소판을 응집시키는 자연 유량 센서입니다. VWF의 해명은 A1 도메인에 혈소판의 결합을 활성화하고 A3 도메인에 결합하는 콜라겐을 활성화시키는 데 필수적이다. 또한, 높은 전단 유도 A2 도메인 전개는 순환5,6에서분자량 분포를 조절VWF의 분열을 허용한다. 따라서, 이 분자가 흐름의 밑에 어떻게 작동하는지의 직접적인 시각화는 그(것)들의 생체 역학 및 기능에 대한 우리의 근본적인 이해를 크게 향상할 수 있고, 이는 차례차례로 새로운 진단 및 치료 응용을 가능하게 할 수 있습니다.
단일 분자 적합성을 특성화하는 일반적인 방법론으로는 광학/자기 핀셋, 원자력 현미경 검사법(AFM) 및 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(FRET)7이포함됩니다. 단 하나 분자 힘 분광학은 생체 분자의 형태 변화와 관련되었던 힘 그리고 운동을 조사하는 강력한 공구입니다. 그러나, 전체 분자 적합성을 매핑하는 능력이 부족하다8. AFM은 높은 공간 해상도로 이미징이 가능하지만 시간해상도9,10으로제한됩니다. 또한, 팁과 샘플 사이의 접촉은 흐름에 의해 유도된 반응을 혼동시킬 수 있다. FRET 및 nanopore 분석과 같은 다른 방법은 분자 내 거리 및 제외 된 볼륨의 검출에 따라 단일 분자 단백질 접기 및 전개 상태를 결정합니다. 그러나, 이들 방법은 아직 초기 단계에 있으며 단일 분자 적합성11,12,13,14의직접적인 관찰에 제한적이다.
한편, 형광 현미경 검사법에 의하여 높은 시간 및 공간 분해능을 가진 거대분자를 직접 관찰하는 것은 많은 생물학적 과정에서 단일 분자 역학에 대한 우리의 이해를 향상시켰습니다15,16. 예를 들어, Fu et al. 최근 처음으로 VWF 신장 및 혈소판 수용체 결합의 동시 시각화를 달성했다. 그들의 작업에서, VWF 분자는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 미세유체 채널의 표면에 고정되었고, 다양한 전단 유동 환경에서 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 이미지화되었다17. Fu’s와 유사한 방법을 적용하여, 우리는 여기에서 VWF와 람다 DNA의 적합성이 TIRF 및 공초점 형광 현미경 검사법 하에서 직접 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 그림 1과같이 미세 유체 장치는 전단 흐름을 생성하고 제어하는 데 사용되며 생체 분자는 채널 표면에 고정됩니다. 다양한 전단 속도의 적용시, 동일한 분자의 적합성은 연장 길이를 측정하기 위해 기록되며, 또한 그림 1에도시된 바와 같습니다. 이 방법은 유변학 및 생물학적 연구를 위해 복잡한 흐름 환경에서 다른 폴리머 거동을 탐구하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법에 설명된 바와 같이 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 구성 변화의 고품질 데이터를 얻으려면 적절한 시간 동안 분자를 배양하고 표면과의 비특이적 상호 작용을 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 광 표백을 줄이는 현미경 설정을 설정합니다. 자유롭게 변형을 변경하는 분자의 능력은 분자와 표면 사이에 형성 된 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용의 수와 관련이 있습니다. 앞서 언급했…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 DMS-1463234, 건강의 국립 연구소 보조금 HL082808 및 AI133634, 및 리하이 대학 내부 자금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
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