Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi
Summary
Vi præsenterer en protokol for immobilisering af enkelte makromolekyler i mikrofluidiske enheder og kvantificereændringer i deres konformationer under forskydningsflow. Denne protokol er nyttig til at karakterisere biomekaniske og funktionelle egenskaber af biomolekyler såsom proteiner og DNA i et flowmiljø.
Abstract
Single-molekyle adfærd under mekanisk forstyrrelser er blevet karakteriseret bredt til at forstå mange biologiske processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrænset tidsmæssig opløsning, mens Förster resonansenergioverførsel (FRET) kun tillader, at konformationer udledes. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, giver real-time in situ visualisering af enkelte molekyler i forskellige flow betingelser. Vores protokol beskriver trinene til at fange kropsbygningsændringer af enkelte biomolekyler under forskellige forskydningsflowmiljøer ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Forskydningsstrømmen skabes inde i mikrofluidiske kanaler og styres af en sprøjtepumpe. Som demonstrationer af metoden, von Willebrand faktor (VWF) og lambda DNA er mærket med biotin og fluorophore og derefter immobiliseret på kanalens overflade. Deres konformationer overvåges løbende under variabel forskydningsstrøm ved hjælp af total intern refleksion (TIRF) og mikroskopi af konfokal fluorescens. VWF’s reversible optrævlingsdynamik er nyttige til at forstå, hvordan dens funktion reguleres i menneskeblod, mens kropsdannelsen af lambda DNA giver indsigt i makromolekylers biofysik. Protokollen kan også anvendes bredt til at studere adfærd polymerer, især biopolymerer, i varierende flow betingelser og til at undersøge reheologi af komplekse væsker.
Introduction
Mekanismer for, hvordan biomolekyler reagerer på miljømæssige stimuli er blevet undersøgt bredt. Især i et flowmiljø regulerer forskydnings- og langstrømskræfter konformationsændringerne og potentielt biomolekylernes funktion. Typiske eksempler omfatter forskydning-induceret optrævling af lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA er blevet brugt som et redskab til at forstå kropsdynamik af individuelle, fleksible polymer kæder og reheologi af polymeropløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig flowsensor, der samler blodplader på sårsteder i blodkarrene med unormale forskydningshastigheder og flowmønstre. Optrævling af VWF er afgørende for aktivering af bindingen af blodplader til A1-domænet og kollagenbinding til A3-domænet. Desuden giver høj forskydnings-induceret A2 domæne udfolder sig kavalergang af VWF, som regulerer sin molekylvægt fordeling i omløb5,6. Således direkte visualisering af, hvordan disse molekyler opfører sig under flow kan i høj grad forbedre vores grundlæggende forståelse af deres biomekanik og funktion, som igen kan muliggøre nye diagnostiske og terapeutiske applikationer.
Typiske metoder til at karakterisere single-molekyle konformationer omfatter optiske / magnetiske pincet, atomkraft mikroskopi (AFM) og single-molekyle Förster resonans energioverførsel (FRET)7. Single-molekyle kraft spektroskopi er et kraftfuldt værktøj til at undersøge den kraft og bevægelse forbundet med konformationændringer af biomolekyler. Men det mangler evnen til at kortlægge samlede molekylære konforringer8. AFM er i stand til billeddannelse med høj rumlig opløsning, men er begrænset i tidsmæssig opløsning9,10. Desuden kan kontakt mellem spidsen og prøven forvirre svaret forårsaget af flow. Andre metoder som FRET og nanopore analyse bestemme enkelt-molekyle protein foldning og udfoldelse stater baseret på påvisning af intramolekylær afstand og udelukkede mængder. Disse metoder er dog stadig i deres vorden og begrænset i deres direkte observation af konforringer med et enkelt molekyle11,12,13,14.
På den anden side har direkte observation af makromolekyler med høj tidsmæssig og rumlig opløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vores forståelse af enmolekyledynamik i mange biologiske processer15,16. For eksempel, Fu et al. nylig opnået samtidig visualisering af VWF forlængelse og blodplade receptor bindende for første gang. I deres arbejde blev VWF molekyler immobiliseret på overfladen af en mikrofluidic kanal gennem biotin-streptavidin interaktioner og afbildet under total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende forskydning flow miljøer17. Ved hjælp af en lignende metode som Fu’s, vi her viser, at konformationer af VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokale fluorescens mikroskopi. Som vist i figur 1anvendes mikrofluidiske anordninger til at skabe og kontrollere forskydningsflow, og biomolekyler immobiliseres på kanalens overflade. Ved anvendelse af forskellige forskydningshastigheder registreres konformationer af samme molekyle for at måle forlængelseslængden, også vist i figur 1. Metoden kunne anvendes bredt til at udforske andre polymer adfærd under komplekse flow miljøer for både reologiske og biologiske undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at opnå data af et enkelt molekylerekonformationsændringer ved hjælp af fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metode er det afgørende at inkubere molekylet i den rette tid, minimere dets uspecifikke interaktioner med overfladen og etablere mikroskopindstillinger, der reducerer fotoblegning. Molekylets evne til frit at ændre kropsbygning er relateret til antallet af biotin-streptavidin interaktioner dannet mellem molekylet og overfladen. Som tidligere nævnt skal dette kontrolleres ved at inkubere molekylet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af en National Science Foundation-legat DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 og AI133634 og Lehigh Universitys interne finansiering.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
