Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Clostridioides difficile infectie (CDI) wordt beschouwd als een van de meest voorkomende gezondheidszorg-geassocieerde gastro-intestinale infecties in de Verenigde Staten. De aangeboren immuunrespons tegen C. difficile is beschreven, maar de exacte rollen van neutrofielen en macrofagen in CDI zijn minder begrepen. In de huidige studie worden Danio rerio (zebravissen) larven gebruikt om een C. difficile infectiemodel vast te stellen voor beeldvorming van het gedrag en de samenwerking van deze aangeboren immuuncellen in vivo. Om C. difficilete controleren, is een etiketteringsprotocol met behulp van een fluorescerende kleurstof ingesteld. Een gelokaliseerde infectie wordt bereikt door micro-injecting gelabeld C. difficile, die actief groeit in de zebravissen darmkanaal en bootst de darmepitheel schade in CDI. Echter, dit directe infectie protocol is invasief en veroorzaakt microscopische wonden, die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Daarom wordt hier een meer niet-invasief microgavageprotocol beschreven. De methode omvat de levering van C. difficile cellen rechtstreeks in de darm van zebravissen larven door intubatie via de open mond. Deze infectie methode bootst nauw de natuurlijke infectie route van C. difficile.
Inleiding
C. difficile is een gram-positieve, spore-vormende, anaërobe en toxine-producerende bacillus dat is de belangrijkste oorzaak van ernstige infecties in het maag-darmkanaal1. Typische symptomen van CDI zijn diarree, buikpijn en fatale pseudomembranous colitis, en het kan soms leiden tot de dood1,2. Bewijs heeft aangetoond dat gastheer immuunreacties een cruciale rol spelen in zowel de progressie als de uitkomst van deze ziekte3. Naast de immuunrespons is de inheemse darmmicrobiota cruciaal voor het begin en de pathogenese van CDI4. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven dierwerkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de wettelijke voorschriften (EU-Richtlijn 2010/63, licentie AZ 325.1.53/56.1-TUBS en licentie AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Bereiding van laagsmeltende Agarose, Gel Plate en Microinjection/Microgavage Naalden
- Los 0,08 g laagsmeltende agarose op (Tabel met materialen, agarose A2576) in 10 mL van 30% Danieau's medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) en 17,4 mM NaCl, opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) om een 0,8% oplossing te verkrijgen.
OPMERKING: Hogere of lag....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
C. difficile is strikt anaeroob, maar de chromofhore van fluorescerende eiwitten vereist meestal zuurstof om te rijpen. Om dit probleem te overwinnen, werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om levende C. difficile cellen die actief groeiden vlekken (R20291, een ribotype 027 stam; Figuur 1A). Met behulp van het Gal4/UAS-systeem werden stabiele transgene zebravislijnen gegenereerd voor live beeldvorming, waarbij de mpeg1.1- of lyZ-promotors
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde methoden wijzigen en breiden een bestaande aanpak uit om zebravissenlarven te infecteren door zowel injectie als microgavage10,14uit te voeren. Het toont ook een benadering aan om anaërobe ziekteverwekkers met zebravissenlarven te bestuderen22. Bovendien vergemakkelijkt het protocol de analyse van aangeboren immuuncelreacties in vivo op CDI en bij kolonisatie van C. difficile bij zebravissen. De methode is reprod.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zijn Timo Fritsch dankbaar voor uitstekende dierenverzorging. Wij danken de leden van de Köster en Steinert labs voor steun en nuttige discussies. We danken Dr. Dandan Han voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de financiering van de deelstaat Nedersaksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | Het wordt gebruikt in agarose platen |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescente kleurstof |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficiënt in melaninesynthese, gebruikt om stabiele transgene lijnen te genereren | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injectienaalden |
| Clostridioides difficile | R20291,, een ribotype 027 stam, TcdA+/TcdB+/CDT+ productie | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Beeldverwerking | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Beeldverwerking | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stabiele transgene lijn waarin de lyZ promotoren de expressie van EGFP fluorescent eiwit in neutrofielen aansturen | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stabiele transgene lijn waarin de mpeg1.1 de expressie van EGFP fluorescent eiwit in macrofagen aansturen | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Referenties
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
