Kvantifisere spatiotemporale parametere av cellulær eksokytose i mikropatternede celler
Summary
Levende avbildning av lysosomal eksokytose på mikropatterned celler tillater en romlig kvantifisering av denne prosessen. Morfologi normalisering ved hjelp av mikropapirer er et fremragende verktøy for å avdekke generelle regler om romlig distribusjon av cellulære prosesser.
Abstract
Levende avbildning av pHluorin merket Løselig N-etylaleimide-sensitive-faktor Vedlegg protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-assosiert membran protein 7 (VAMP7) av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måte å utforske sekresjon fra lysosomale rommet. Ved å dra nytte av cellekultur på mikromønstrede overflater for å normalisere celleformen, ble en rekke statistiske verktøy brukt til å utføre en romlig analyse av sekretoriske mønstre. Ved hjelp av Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand (NND), bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldig prosess, men viser betydelig klynger. Av notatet viste vår analyse at eksocytosehendelser også er gruppert i ikke-adhesjonsområder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel fant vi ut at celleadhesjon forbedrer klynger. I tillegg til nøyaktig definerte klebende og ikke-adhemmende områder, tillater den sirkulære geometrien til disse mikropapirene bruk av polare koordinater, noe som forenkler analyser. Vi brukte Kernel Density Estimering (KDE) og den kumulative fordelingsfunksjonen på polare koordinater av eksocytosehendelser for å identifisere berikede områder av eksocytose. I ringformede mikropatternceller oppstod klynger på grensen mellom klebemiddelet og ikke-adhesive områder. Vår analyse illustrerer hvordan statistiske verktøy kan brukes til å undersøke romlige fordelinger av ulike biologiske prosesser.
Introduction
Exocytosis er en universell cellulær prosess der en vesikkel smelter sammen med plasmamembranen og frigjør innholdet. Vesikkelen kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (full fusjon) eller skape en fusjonspor som holder åpent i en begrenset periode (kyss-og-løp)1. For eksempel frigjøres nylig syntetiserte proteiner i det ekstracellulære mediet fra vesikler som kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde banen er primordial, spesielt i flercellede organismer, å skille ut signalering peptider (f.eks hormoner, nevrotransmittere) og ekstracellulære matrisekomponenter (f.eks kollagen), samt trafikktransmembranproteiner til plasmamembranen. I tillegg kan sekreter forekomme fra forskjellige endosomer: 1) resirkulering endosomer for å gjenbruke transmembrane proteiner; 2) multivesikulære organer (MVB) for å frigjøre eksosomer; og 3) lysosomer for frigjøring av proteolytiske enzymer. Endosomal sekresjon har vist seg å være viktig for neuritt utvekst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparasjon, og ATP-avhengig signalering2.
For å studere eksocytose på enkeltcellenivå, har flere teknikker blitt brukt. Patch-clamp gjør det mulig å oppdage enkelt exocytosis hendelser med høy temporal oppløsning i et bredt utvalg av levende celler3. Denne metoden gir imidlertid ikke informasjon om lokalisering av exocytosehendelser, heller ikke fra hvilket rom det oppstår. Elektronmikroskopi tillater direkte visualisering av eksokytiske hendelser med høy romlig oppløsning, og i kombinasjon med immunolabeling gir informasjon om spesifisiteten til rommene og molekylene som er involvert. En ulempe med denne tilnærmingen er mangelen på informasjon om dynamikken i prosessen, samt dens manglende evne til å utføre høy gjennomstrømningsstudier. Lett mikroskopi tilnærminger som total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), som utnytter evanescent feltet for å belyse fluoroforer i nærheten av coverslip (100 nm), gir god timelig og romlig oppløsning for å studere exocytosis hendelser. Denne metoden er imidlertid bare kompatibel med tiltalende celler og kan bare brukes på ventral / dårligere del av celler.
Merk at plasmamembranen avslører betydelig heterogenitet basert på klebende komplekser som bare finnes i begrensede områder. Denne heterogeniteten begrenser for eksempel opptaket av forskjellige ligande4. Tilsvarende har det nylig blitt rapportert at sekresjon fra Golgi-komplekset er konsentrert på “hot spots” i plasmamembranen5. Videre er det kjent at visse laster utskilles gjennom fokal-vedheft-assosiert exocytosis6. Dermed bør spesiell oppmerksomhet rettes mot spørsmålet om eksocytosehendelser fordeles tilfeldig i rommet, eller om de er konsentrert på bestemte områder av plasmamembranen. Flere statistiske verktøy basert på Ripleys K-funksjon har blitt foreslått å utforske dissespørsmålene 7,8,9. Vår tilnærming kombinerer disse verktøyene med mikropattering for å kontrollere celleform og plasmamembran heterogenitet. I tillegg til å gi et middel til å skille mellom lim og ikke-adhemmende områder, tillater denne teknikken også sammenligning på tvers av forskjellige celler og forhold og øker kraften i statistiske analyser.
Her bruker vi en rekke statistiske verktøy for å studere romlig fordeling av eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet overvåket av TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte hTert-RPE1-celler. Det ble bekreftet at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9 og at exocytosis hendelser viser klynger. Merk at exocytosis hendelser også er gruppert i ikke-adhesive områder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel forbedret celleadhesjon klynger. Konsekvent identifiserte vår analyse berikede områder av eksocytose som lå ved grensen mellom klebemiddel og ikke-adhesive områder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi overvåket eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet ved TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte celler og utførte en streng statistisk analyse av de romlige parametrene for exocytosehendelser. Ved hjelp av den forvandlede Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand, bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9. Begge statistiske analyser viste overbev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Thierry Galli (Senter for psykiatri og nevrovitenskap, INSERM) for å gi VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for råd om statistisk analyse og medlemmer av GOUD-laboratoriet for fruktbare diskusjoner. Forfatterne anerkjenner i stor grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. ble støttet av Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) og P.M. mottok støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale no 666003. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
