Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение
Summary
Анализ потопа саженцев облегчает быстрый скрининг диких томатов на устойчивость к бактерии Pseudomonas шприцев. Этот опрос, используемый в сочетании с рассеиванием бактериального роста, может помочь в дальнейшей характеристике основной резистентности к бактерии, и может быть использован для отображения данных для определения генетической основы резистентности.
Abstract
Помидор является агрономически важной культурой, которая может быть заражена Pseudomonas шприцев, Грам-отрицательных бактерий, в результате бактериальной болезни пятнышко. Помидор-P. syringae pv. томатная патосистема широко используется для вскрытия генетической основы врожденных реакций растений и устойчивости к болезням. В то время как болезнь успешно управляется в течение многих десятилетий путем введения кластера генов Pto/Prf из Solanum pimpinellifolium в культивируемые помидоры, раса 1 штаммов P. syringae эволюционировали, чтобы преодолеть сопротивление, присуждаемое кластером генов Pto/Prf и происходит во всем мире.
Дикие виды томатов являются важными резервуарами естественного разнообразия в распознавании патогенов, потому что они развивались в различных средах с различным иным патогенным давлением. В типичных экранах для сопротивления заболевания в одичалых томатах, взрослые заводы использованы, которые могут ограничивать число заводов которые можно экранировать из-за их выдвинутого времени роста и больших требований пространства роста. Мы разработали метод проверки 10-дневных саженцев томатов на устойчивость, который минимизирует время роста растений и пространство камеры роста, позволяет быстро текучесть растений, и позволяет проверить большие размеры выборки. Результаты семени выживания или смерти можно рассматривать как дискретные фенотипы или по шкале сопротивления, определяемой количеством нового роста выживших саженцев после наводнения. Этот метод был оптимизирован для проверки 10-дневных саженцев томатов на устойчивость к двум штаммам P. syringae и может быть легко адаптирован к другим штаммам P. syringae.
Introduction
Pseudomonas syringae является грамотрицательным патогенной бактерией, которая заражает широкий спектр растительных хозяев. Бактерии попадают в растение-хозяина через стоматы или физические раны и размножаться в апопласте 1. Растения развили двухуровневый иммунный ответ для защиты от инфекции бактериальными патогенами. Первый уровень происходит на поверхности клеток растений, где рецепторы распознавания образов на мембране клеток растений воспринимают высоко консервированные патогенно-ассоциированные молекулярные модели (PAMPs) в процессе, называемом PAMP-спровоцированный иммунитет (PTI)2. В ходе этого процесса, хозяин завода upregulates пути обороны ответ, в том числе осаждение кальяны на клеточной стенке, закрытие стомата, производство реактивных видов кислорода, и индукции патогенеза связанных генов.
Бактерии могут преодолеть PTI, используя систему секреции типа III для доставки белков, называемых эффекторами, непосредственно в клетку растения3. Эффекторные белки обычно нацелены на компоненты PTI и способствуют патогенной вирулентности4. Второй уровень растительного иммунитета возникает в растительной клетке при распознавании белков-эффекторов. Это признание зависит от генов устойчивости, которые кодируют нуклеотид-связывающий сайт, богатый лейкином, содержащий рецепторы (НЛР). НЛР способны либо распознавать эффекторов напрямую, либо распознавать их активность на вирулентности или приманку5. Затем они вызывают вторичный иммунный ответ в процессе, называемом эффектор-спровоцированный иммунитет (ETI), который часто связан с гиперчувствительной реакции (HR), форма локализованной смерти клеток в месте инфекции6. В отличие от генной резистентности, связанной с ETI, растения могут проявлять количественную частичную резистентность, которая зависит от вклада нескольких генов7.
P. syringae pv. помидор (Pst) является причинным агентом бактериальной пятнышко на помидоры и является постоянной сельскохозяйственной проблемой. Преобладающие штаммы в этой области, как правило, были Pst расы 0 штаммов, которые выражают либо или оба типа III эффекторов AvrPto и AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) является репрезентативной расы 0 штамма и модель патогена, который может вызвать бактериальные пятнышко в томатах. Для борьбы с бактериальной болезнью пятнышка, заводчики introgressed Pto pto p. syringae pv. помидоры/Prf –устойчивость Пто и чувствительность фентиона– генкластер из дикого вида томатов Solanum pimpinellifolium в современные сорта8,9. Ген Пто кодирует серино-threonine белка киназы, что, вместе с Prf NLR, придают устойчивость к PstDC3000 через признание эффекторов AvrPto и AvrPtoB10,11,12,13,14. Тем не менее, это сопротивление является неэффективным против возникающих расы 1 штаммов, что позволяет их быстрого и агрессивного распространения в последние годы15,16. Штаммы гонки 1 уклоняются от признания кластера Pto/Prf, потому что AvrPto либо теряется, либо мутирует в этих штаммах, а AvrPtoB, кажется, накапливает минимально15,17,18.
Дикие популяции томатов являются важными резервуарами естественного изменения устойчивости Pst и ранее использовались для выявления потенциальной устойчивости локусов19,20,21. Тем не менее, текущие экраны для возбудителя устойчивость использовать 4-5-недельный взрослых растений20,21. Таким образом, они ограничены временем роста, пространством камеры роста и относительно небольшими размерами выборки. Для устранения ограничений обычных подходов, мы разработали высокой пропускной томатной P. syringae сопротивление с использованием 10-дневных саженцев помидоров22. Этот подход предлагает ряд преимуществ по сравнению с использованием взрослых растений: а именно, более короткое время роста, снижение требований к пространству, и более высокую пропускную стоимость. Кроме того, мы продемонстрировали, что этот подход точно резюмирует фенотипы устойчивости к болезням, наблюдаемые у взрослых растений22.
В рассаде наводнений, описанных в этом протоколе, саженцы помидоров выращиваются на чашках Петри стерильных Мурашиге и Skoog (MS) сми в течение 10 дней, а затем наводнены инокулум, содержащий бактерии интереса и сурфактант. После наводнения, саженцы могут быть количественно оценены на устойчивость к болезням с помощью бактериальных анализов роста. Кроме того, выживание рассады или смерть может выступать в качестве дискретной резистентности или фенотипа болезни 7-14 дней после наводнения. Этот подход предлагает высокую пропускную стоимость альтернативу для скрининга большого количества диких томатов для сопротивления Pst расы 1 штаммов, таких как Штамм Pst T1 (PstT1), и может быть легко адаптирована к другим бактериальным штаммам интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан протокол прививки от наводнений pstDC3000 или PstT1, оптимизированный для обнаружения устойчивости к этим бактериальным штаммам в саженцах помидоров. Есть несколько критических параметров для оптимальных результатов в растестировани на саженец, включая концентрацию бакте?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джейми Кальму за тестирование влияния объема средств массовой информации на результаты болезней или резистентности. Мы благодарим д-ра Маэля Бодена и д-ра Карла Ш.Шайбера из лаборатории Льюиса за предоставление конструктивных замечаний и предложений по рукописи. Исследования иммунитета растений в лаборатории Льюиса были поддержаны USDA ARS 2030-21000-046-00D и 2030-21000-050-00D (JDL) и Управлением по биологическим наукам NSF IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. Genetics. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
