दंत लुगदी पैराक्रिन सिग्नल के जवाब में न्यूराइट आउटग्रोथ का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि
Summary
हम ट्राइजेमिनल (टीजी) न्यूरॉन्स के साथ दंत लुगदी (डीपी) प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव, फैलाव और चढ़ाना का वर्णन करते हैं जो ओवरलाइंग ट्रांसवेल फिल्टर के ऊपर सुसंस्कृत हैं। डीपी कोशिकाओं की सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण प्रतिरक्षण या आरएनए/प्रोटीन विश्लेषण के साथ किया जा सकता है । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरोनल मार्कर की इम्यूनोफ्लोरेसेंस न्यूराइट आउटग्रोथ प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
दांत अंतरावण दांतों को दबाव, तापमान और सूजन को समझने की अनुमति देता है, जो सभी दांत के अंग के उपयोग और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। संवेदी अंतरावण के बिना, दैनिक मौखिक गतिविधियों अपूरणीय क्षति का कारण होगा। इसके महत्व के बावजूद, दांत विकास और रखरखाव में अंतरावता की भूमिकाओं को काफी हद तक अनदेखा किया गया है । कई अध्ययनों से पता चला है कि डीपी कोशिकाओं को आकर्षित करने और दांत भर में टीजी एक्सन गाइड करने के लिए एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन और पैराक्रिन संकेतों स्राव । हालांकि, कुछ अध्ययनों ने डीपी मेसेनचिम और न्यूरोनल एफ्रेंट्स के बीच क्रॉसटॉक में विस्तृत जानकारी प्रदान की है। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने इन बातचीत की जांच करने के लिए सह-संस्कृतियों और विभिन्न तकनीकों का उपयोग करना शुरू कर दिया है । यहां, हम टीजी न्यूरॉन्स के साथ प्राथमिक डीपी कोशिकाओं को सह-खेती करने में शामिल कई चरणों को प्रदर्शित करते हैं जो छिद्रों के माध्यम से अक्षीय विकास की अनुमति देने के लिए बड़े व्यास छिद्रों के साथ एक अंतर्निहित ट्रांसवेल फिल्टर पर फैले हुए हैं। लोक्सपी साइटों द्वारा घिरे ब्याज के जीन के साथ प्राथमिक डीपी कोशिकाओं का उपयोग एडेनोवायरस-क्रे-जीएफपी पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके जीन विलोपन को सुविधाजनक बनाने के लिए किया गया था। थाय1-वाईएफपी माउस से टीजी न्यूरॉन्स का उपयोग सटीक afferent इमेजिंग के लिए अनुमति दी, अभिव्यक्ति के साथ अच्छी तरह से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर । डीपी प्रतिक्रियाओं की जांच प्रोटीन या आरएनए संग्रह और विश्लेषण के माध्यम से की जा सकती है, या वैकल्पिक रूप से, हटाने योग्य ग्लास कवरस्लिप पर चढ़ाए गए डीपी कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से। मीडिया को प्रोटेओमिक विश्लेषण जैसी तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, हालांकि मीडिया में भ्रूण गोजातीय सीरम की उपस्थिति के कारण एल्बुमिन कमी की आवश्यकता होगी। यह प्रोटोकॉल एक सरल विधि प्रदान करता है जिसे सह-संस्कृति परख के नियंत्रित वातावरण के जवाब में टीजी न्यूरॉन्स और डीपी कोशिकाओं की रूपात्मक, आनुवंशिक और साइटोस्केलेटल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है।
Introduction
दांत अंतरावण दांतों को दबाव, तापमान और सूजन को समझने की अनुमति देता है, जो सभी दांत के अंग के उपयोग और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। दंत क्षय और आघात से जुड़े दांतदर्द को समझने में विफलता रोग प्रगति की ओर ले जाती है। इस प्रकार, उचित अंतरावण सामान्य दांत के विकास, कार्य और देखभाल के लिए एक आवश्यकता है।
जबकि अधिकांश अंग जन्म के समय पूरी तरह से कार्यात्मक और आंतरिक होते हैं, दांत का विकास वयस्क जीवन में फैला हुआ है, दांत अंतरावण और खनिजीकरण प्रसवोत्तर चरणों के दौरान संगीत कार्यक्रम में होने वाली1,2। दिलचस्प बात यह है कि दंत लुगदी (डीपी) मेसेनचिम शुरू में भ्रूण उत्पत्ति के दौरान रिपेलेंट संकेतों को स्रावित करता है ताकि विकासशील दांत अंग में एक्सॉन प्रवेश को रोका जा सके, जो बाद में आकर्षित कारकों के स्राव में बदलाव करता है क्योंकि दांत विस्फोट3,4के पास होता है। प्रसवोत्तर चरणों के दौरान, ट्राइजेमिनल (टीजी) तंत्रिका से एफ्रेरेंट एक्सोन उस समय के आसपास दांत में और पूरे दांत में प्रवेश करते हैं ( पेजला, पी एट अल5में समीक्षा की जाती है)। वीवो अध्ययनों में कई ने दिखा दिया है कि चूहों में न्यूरोनल-मेसेनचिमल इंटरैक्शन गाइड दांत अंतरण (लुक्को, के एट अल6में समीक्षा की गई), लेकिन आणविक तंत्र के कुछ विवरण उपलब्ध हैं।
सेल सह संस्कृतियों नियंत्रित वातावरण है जिसमें जांचकर्ताओं न्यूरोनल और मेसेनचिमल आबादी के बीच बातचीत में हेरफेर कर सकते है प्रदान करते हैं । सह संस्कृति प्रयोगों यह संभव संकेत दांत अंतरीय नहोने और विकास मार्गदर्शक रास्तों में गहरी तल्लीन करना बनाते हैं । हालांकि, सह-संस्कृति में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई पारंपरिक तरीकों में तकनीकी चुनौतियां मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, न्यूराइट आउटग्रोथ के क्रिस्टल वायलेट धुंधला टीजी बंडल फैलाव में शामिल गैर-विशेष रूप से दाग श्वान कोशिकाओं कर सकते हैं, और अपेक्षाकृत छोटी प्रतिक्रियाओं के साथ रंग तीव्रता में चोटियां हो सकती हैं7। माइक्रोफ्लूइडिक कक्ष एक आकर्षक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन ट्रांसवेल फिल्टर8,9 की तुलना में काफी अधिक महंगे हैं और केवल डीपी स्राव के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देते हैं। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो टीजी स्राव के जवाब में टीजी न्यूराइट आउटग्रोथ की सटीक धुंधला और इमेजिंग की अनुमति देता है, ख) डीपी कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन और/या टीजी न्यूरॉन्स विशिष्ट सिग्नलिंग रास्तों की जांच करने के लिए, और सी) टीजी न्यूरॉन्स द्वारा स्रावित कारकों के लिए डीपी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच । यह प्रोटोकॉल एक इन विट्रो सह-संस्कृति परख के नियंत्रित वातावरण में दांत अंतरावशन की कई विशेषताओं की सटीक जांच करने की क्षमता प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मौखिक गुहा की दैनिक गतिविधियों के लिए उचित उपयोग और रखरखाव की अनुमति देने के लिए दांतबाहरी उत्तेजनाओं और आंतरिक सूजन को समझने की आवश्यकता होती है। हालांकि, दांत अंतरावशन की विकास प्रक्रियाओं को चलान?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च/नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, बी) बर्मिंघम डेंटल एकेडमिक रिसर्च ट्रेनिंग (डार्ट) ग्रांट (नंबर T90DE022736 (PI MacDougall)) में अलबामा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। ग) क्रैनियोफेशियल, ओरल एंड डेंटल डिसऑर्डर्स (जीसी-कोडेड) पायलट और एसबीपी और डी को व्यवहार्यता अनुदान के लिए एक यूएबी ग्लोबल सेंटर) नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनिओफेशियल एसबीपी को शोध/राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K99 DE024406 अनुदान।
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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