Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen
Summary
We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.
Abstract
Tand innervation laat tanden om druk, temperatuur en ontsteking te voelen, die allemaal cruciaal zijn voor het gebruik en onderhoud van het tandorgaan. Zonder zintuiglijke innervatie zouden dagelijkse orale activiteiten onherstelbare schade veroorzaken. Ondanks het belang ervan, zijn de rollen van innervatie in tandontwikkeling en onderhoud grotendeels over het hoofd gezien. Verschillende studies hebben aangetoond dat DP cellen scheiden extracellulaire matrix eiwitten en paracrine signalen aan te trekken en te begeleiden TG axonen in en door de tand. Echter, weinig studies hebben gedetailleerd inzicht in de crosstalk tussen de DP mesenchyme en neuronale afferents. Om deze kloof in kennis aan te pakken, zijn onderzoekers begonnen met het gebruik van co-culturen en een verscheidenheid aan technieken om deze interacties te onderzoeken. Hier demonstreren we de vele stappen die betrokken zijn bij co-culturing primaire DP cellen met TG neuronen verspreid over een bovenliggende transwell filter met grote diameter poriën om axonale groei door de poriën mogelijk te maken. Primaire DP-cellen met het gen van belang geflankeerd door loxP-sites werden gebruikt om genverwijdering te vergemakkelijken met behulp van een Adenovirus-Cre-GFP recombinase systeem. Met behulp van TG neuronen van de Thy1-YFP muis toegestaan voor nauwkeurige afferente beeldvorming, met expressie ruim boven achtergrondniveaus door confocale microscopie. De DP-reacties kunnen worden onderzocht via eiwit- of RNA-verzameling en -analyse, of als alternatief door immunofluorescerende vlekken van DP-cellen die zijn verguld op verwijderbare glashoezen. Media kunnen worden geanalyseerd met behulp van technieken zoals proteomische analyses, hoewel dit zal vereisen albumine uitputting als gevolg van de aanwezigheid van foetale runderserum in de media. Dit protocol biedt een eenvoudige methode die kan worden gemanipuleerd om de morfologische, genetische en cytoskeletreacties van TG-neuronen en DP-cellen te bestuderen in reactie op de gecontroleerde omgeving van een co-cultuurtest.
Introduction
Tand innervation laat tanden om druk, temperatuur en ontsteking te voelen, die allemaal cruciaal zijn voor het gebruik en onderhoud van het tandorgaan. Niet te voelen tandpijn geassocieerd met tandheelkundige cariën en trauma leidt tot ziekte progressie. Zo is een goede innervatie een vereiste voor normale tandgroei, functie en zorg.
Terwijl de meeste organen zijn volledig functioneel en innervated door de tijd van geboorte, tand ontwikkeling strekt zich uit tot volwassen leven, met tand innervation en mineralisatie die zich in overleg tijdens postnatale stadia1,2. Interessant is dat de tandheelkundige pulp (DP) mesenchyme in eerste instantie afwerende signalen scheidt tijdens embryogenese om axon binnenkomst in het zich ontwikkelende tandorgaan te voorkomen, dat later verschuift naar de afscheiding van attractante factoren als de tand nadert uitbarsting3,4. Tijdens postnatale stadia dringen afferente axonen van de trigeminus (TG) zenuw in en door de tand rond de tijd dat dentin depositie begint (beoordeeld in Pagella, P. et al.5). Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat neuronale-mesenchymale interacties leiden tand innervation in muizen (beoordeeld in Luukko, K. et al.6), maar weinig details van de moleculaire mechanismen beschikbaar zijn.
Celcoculturen bieden gecontroleerde omgevingen waarin onderzoekers interacties tussen neuronale en mesenchymale populaties kunnen manipuleren. Co-cultuur experimenten maken het mogelijk om dieper te verdiepen in de signalering trajecten begeleiden tand innervation en ontwikkeling. Echter, een aantal van de conventionele methoden die worden gebruikt om cellen te bestuderen in co-cultuur presenteren technische uitdagingen. Bijvoorbeeld, kristal violet vlekken van neurite uitgroei kan niet-specifiek vlek Schwann cellen opgenomen in TG bundel dispersies, en er kunnen pieken in kleurintensiteit met relatief kleine reacties7. Microfluïde kamers bieden een aantrekkelijke optie, maar zijn aanzienlijk duurder dan transwell filters8,9 en alleen toestaan dat het onderzoek van neuronale reacties op DP afscheidingen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld dat het mogelijk maakt: a) nauwkeurige kleuring en beeldvorming van TG neurite uitgroei in reactie op DP secreties, b) genetische modificatie van DP-cellen en /of TG-neuronen om specifieke signaleringstrajecten te onderzoeken, en c) onderzoek naar DP-celreacties op factoren die door TG-neuronen worden afgescheiden. Dit protocol biedt de mogelijkheid om nauwkeurig te onderzoeken verschillende kenmerken van tandinnervation in de gecontroleerde omgeving van een in vitro co-cultuur test.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dagelijkse activiteiten van de mondholte vereisen dat tanden externe stimuli en interne ontstekingen voelen om een goed gebruik en onderhoud mogelijk te maken. Er is echter slechts beperkte informatie beschikbaar over de signalen die de ontwikkelingsprocessen van tandinnervation stimuleren. Dit protocol biedt een methode om primaire DP-cellen en TG-neuronen te isoleren en co-cultuur te vormen om de onderlinge communicatie tussen de twee populaties te bestuderen. Verschillende variabelen werden geoptimaliseerd en laten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door a) de National Institutes of Health /NIAMS (subsidienummers R01 AR062507 en R01 AR053860 aan RS), b) de Universiteit van Alabama in Birmingham Dental Academic Research Training (DART) subsidie (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) aan SBP van het National Institute of Dental and Craniofacial Research /National Institutes of Health, c) een UAB Global Center for Craniofaciale, orale en tandheelkundige aandoeningen (GC-CODED) Pilot en haalbaarheidssubsidie aan SBP en d) het National Institute of Dental and Craniofacial Onderzoek / National Institutes of Health K99 DE024406 subsidie aan SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
