Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental
Summary
Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.
Abstract
La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. Sin la inervación sensorial, las actividades orales diarias causarían daños irreparables. A pesar de su importancia, los papeles de la inervación en el desarrollo y mantenimiento de los dientes se han pasado por alto en gran medida. Varios estudios han demostrado que las células DP secretan proteínas de matriz extracelular y señales paracrinas para atraer y guiar los axones TG dentro y a lo largo del diente. Sin embargo, pocos estudios han proporcionado información detallada sobre la conversación cruzada entre el mesenquime DP y los afferents neuronales. Para abordar esta brecha en el conocimiento, los investigadores han comenzado a utilizar cocultivos y una variedad de técnicas para investigar estas interacciones. Aquí, demostramos los múltiples pasos involucrados en el co-cultivo de células DP primarias con neuronas TG dispersas en un filtro transwell overlying con poros de gran diámetro para permitir el crecimiento axonal a través de los poros. Las células primarias de DP con el gen de interés flanqueado por sitios loxP se utilizaron para facilitar la eliminación de genes utilizando un sistema de recombinación Adenovirus-Cre-GFP. El uso de neuronas TG del ratón Thy1-YFP permitió imágenes precisas aferentes, con una expresión muy por encima de los niveles de fondo mediante microscopía confocal. Las respuestas DP se pueden investigar a través de la recolección y análisis de proteínas o ARN, o alternativamente, a través de la tinción inmunofluorescente de células DP chapadas en tapas de vidrio extraíbles. Los medios se pueden analizar utilizando técnicas como los análisis proteómicos, aunque esto requerirá agotamiento de la albúmina debido a la presencia de suero bovino fetal en los medios. Este protocolo proporciona un método simple que se puede manipular para estudiar las respuestas morfológicas, genéticas y citoesqueléticas de las neuronas TG y células DP en respuesta al entorno controlado de un ensayo de cocultivo.
Introduction
La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. La falta de detección del dolor dental asociado con la caries dental y el trauma tensias conduce a la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la inervación adecuada es un requisito para el crecimiento normal de los dientes, la función y el cuidado.
Mientras que la mayoría de los órganos son completamente funcionales e inervados en el momento del nacimiento, el desarrollo dental se extiende a la vida adulta, con la inervación dental y la mineralización que se produce en concierto durante las etapas postnatales1,2. Curiosamente, el mesenquimo de pulpa dental (DP) inicialmente secreta señales repelentes durante la embriogénesis para evitar la entrada de axón en el órgano dental en desarrollo, que más tarde se desplaza a la secreción de factores de atracción a medida que el diente se acerca a la erupción3,4. Durante las etapas posnatales, los axones aferentes del nervio trigémino (TG) penetran en y a lo largo del diente alrededor del momento en que comienza la deposición de la dentina (revisado en Pagella, P. et al.5). Varios estudios in vivo han demostrado que las interacciones neuronales-mesenquimales guían la inervación dental en ratones (revisado en Luukko, K. et al.6), pero pocos detalles de los mecanismos moleculares están disponibles.
Los cocultivos celulares proporcionan entornos controlados en los que los investigadores pueden manipular las interacciones entre las poblaciones neuronal y mesenquimales. Los experimentos de cocultivo permiten profundizar en las vías de señalización que guían la inervación y el desarrollo de los dientes. Sin embargo, varios de los métodos convencionales utilizados para estudiar células en cocultivo presentan desafíos técnicos. Por ejemplo, la tinción violeta cristalina del crecimiento de neurita puede manchar no específicamente las células Schwann incluidas en las dispersiones del haz tG, y puede haber picos de intensidad de color con respuestas relativamente pequeñas7. Las cámaras microfluídicas ofrecen una opción atractiva, pero son considerablemente más caras que los filtros transwell8,9 y solo permiten la investigación de las respuestas neuronales a las secreciones del PD. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite: a) la tinción precisa y la toma de imágenes del crecimiento de neurita TG en respuesta a las secreciones de DP, b) la modificación genética de las células DP y / o neuronas TG para investigar vías de señalización específicas, y c) la investigación de las respuestas celulares DP a los factores secretados por las neuronas TG. Este protocolo proporciona la capacidad de investigar con precisión varias características de la inervación dental en el entorno controlado de un ensayo de cocultivo in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las actividades diarias de la cavidad oral requieren que los dientes sienten los estímulos externos y la inflamación interna con el fin de permitir el uso adecuado y el mantenimiento. Sin embargo, sólo se dispone de información limitada con respecto a las señales que impulsan los procesos de desarrollo de la inervación dental. Este protocolo proporciona un método para aislar y co-cultivar células DP primarias y neuronas TG con el fin de estudiar la comunicación cruzada entre las dos poblaciones. Se optimizaron v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por a) la beca National Institutes of Health/NIAMS (números de subvención R01 AR062507 y R01 AR053860 a RS), b) la beca de formación académica dental de la Universidad de Alabama en Birmingham (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) al PAS del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (DART) c) una subvención piloto y de viabilidad del Centro Global de Trastornos Craneofaciales, Orales y Dentales (GC-CODED) de la UAB a la PAS y d) al Instituto Nacional de Trastornos Dentales y Craneofaciales Investigación/Institutos Nacionales de Salud K99 DE024406 a Pas pasión.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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