In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden bestudeerd.
De neurosfeer test is een zeer nuttig in vitro techniek voor het bestuderen van de inherente eigenschappen van neurale stam / voorloper cellen (NSSPCs) met inbegrip van proliferatie, zelf-vernieuwing en multipotentie. In het postnatale en volwassen brein zijn NSPC’s voornamelijk aanwezig in twee neurogene nissen: de subventriculaire zone (SVZ) langs de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampaldentate gyrus (DG). De isolatie van de neurogene niches van postnatale hersenen maakt het verkrijgen van een hogere hoeveelheid NSSPCs in de cultuur met een daaruit voortvloeiend voordeel van hogere opbrengsten. Het nauwe contact tussen cellen binnen elke neurosfeer creëert een micro-omgeving die kan lijken op neurogene niches. Hier beschrijven we in detail hoe we SVZ- en DG-afgeleide neurosfeerculturen kunnen genereren van 1-3-dagenoude (P1−3) muizen, evenals passaging, voor neurosfeeruitbreiding. Dit is een voordelige benadering omdat de neurosfeertest een snelle generatie NSPC-klonen (6−12 dagen) mogelijk maakt en bijdraagt aan een aanzienlijke vermindering van het aantal dierlijke toepassingen. Door neurosferen in differentiërende omstandigheden te platen, kunnen we een pseudomonolayer verkrijgen van cellen bestaande uit NSPC’s en gedifferentieerde cellen van verschillende neurale geslachten (neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) waardoor de acties van intrinsieke of extrinsieke factoren op NSPC-proliferatie, differentiatie, celoverleving en neuritogenese kunnen worden bestudeerd.
De neurosfeer test (NSA) werd eerst beschreven in 19921,2 en nog steeds een uniek en krachtig instrument in neurale stamcel (NSC) onderzoek. De isolatie van NSC’s uit de belangrijkste neurogene regio’s heeft uitdagende problemen omdat de vereisten om deze cellen in fysiologische omstandigheden te behouden slecht begrepen blijven. In de NSA worden cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd serumvrij medium met de aanwezigheid van groeifactoren, waaronder de epidermale groeifactor (EFG) en de basisgroeifactor voor fibroblasten (bFGF)1,2,3. Neurale voorlopercellen (stamcellen en voorlopers) worden geselecteerd met behulp van deze mitogenen, omdat deze cellen EFG en FGF-responsief zijn die een periode van actieve proliferatie binnenkomen, terwijl andere cellen, namelijk gedifferentieerde cellen, sterven4. Neurale voorlopercellen groeien als neurosferen, die vervolgens kunnen worden doorgestoid om de pool van deze cellen verder uit te breiden5. Belangrijk is dat, aangezien deze neurale stam voorloper cellen (NSSPCs) zijn multipotent ze in staat zijn om te differentiëren in de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS): neuronen, oligodendrocyten en astrocyten5.
De NSA biedt een hernieuwbare bron van ongedifferentieerde CNS-precursoren, die kunnen worden gebruikt om verschillende processen te bestuderen, waaronder NSC-proliferatie en zelfvernieuwing, en neuronale en gliadifferentiatie, zowel in fysiologische als in ziektecontext. Bovendien kunnen in vitro studies worden gebruikt om de mate van intrinsieke specificatie die aanwezig is in neurale precursoren tijdens de ontwikkeling te evalueren, evenals om het volledige potentieel van de cellen te bestuderen, door het verwijderen van extrinsieke signalen in verband met hun normale omgeving6. Het neurosfeermodel is waardevol om putatieve regelgevers te evalueren, aangezien door het handhaven van de cellen in een medium zonder serum, de milieusignalen alleen worden geleverd door de omringende cellen6. Bovendien zijn nssspc’s in de NSA gemakkelijk uit te breiden in cultuur, is de dichtheid van cellen per gebied hoog en heeft de heterogene samenstelling van de neurosferen enige gelijkenis met in vivo niches6. Deze gevestigde voordelen zijn de reden waarom deze methodologie is op grote schaal gebruikt door veel onderzoekers.
Het volgende protocol beschrijft in detail alle processen van de isolatie van de postnatale NSPC-populatie uit de twee belangrijkste neurogene regio’s, de subventriculaire zone (SVZ) en de hippocampaldentategyrus (DG), tot de uitbreiding van die cellen als neurosferen, evenals tot de differentiatie in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Ten slotte worden ook verschillende tests beschreven om toegang te krijgen tot stamness en multipotentie-eigenschappen van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs.
In vitro systemen van NSC’s zorgen voor een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen, die verder kunnen worden gevalideerd in vivo. De NSA is een zeer krachtige methode om fysiologische omstandigheden na te bootsen als gevolg van hun driedimensionale structuur. Bovendien is dit cultuursysteem technisch ook gemakkelijker te kweken10, in vergelijking met andere in vitro systemen zoals het monolayer cultuursysteem. Inderdaad, met de NSA, is het gemakkelijk om de blootgestelde extrinsieke signalen tijdens de celontwikkeling te controleren, hetzij tijdens de expansie- of differentiatiefase, door nauwkeurige en variabele hoeveelheden factoren toe te voegen die van belang zijn voor de media en door neurosferen te kweken met andere celtypen6. Bovendien is het in vergelijking met monolayerculturen in de NSA mogelijk om een hogere celdichtheid te verkrijgen uit een kleine hoeveelheid weefsel of met een klein aantal cellen, waardoor parallelle studies kunnen worden uitgevoerd, waardoor het aantal dieren kan wordenverminderd 1.
De NSA is de meest voorkomende methode om NSC’s te isoleren en uit te breiden11,12,13, kan worden gebruikt om het aantal voorlopercellen aanwezig in een bepaald weefselmonster5 en de voorlopercelfrequentie tussen verschillende omstandigheden te schatten. Echter, zowel neurosferen en monolayer culturen geen rekening houden met rust NSCs14. Bovendien heeft de NSA een aantal beperkingen11,12,13 en de resulterende neurosfeerfrequentie is afhankelijk van vele factoren, waaronder de medium componenten, de dissectieprocedure, het dissociatieproces11,12,13, en neurosfeeraggregatie5. Inderdaad, in een cultuur met hoge dichtheid, neurosferen hebben de neiging om samen te voegen. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het schatten van het aantal voorlopercellen in een monster. Om bovenstaande beperkingen te overwinnen, kunnen geïsoleerde NSSPCs ook worden uitgebreid en doorgetrokken in een monolayer5,15. Belangrijk is dat het gebruik van NSA om de frequentie van voorlopercellen tussen verschillende omstandigheden te vergelijken zeer nuttig en nauwkeurig is, omdat al deze beperkingen impliciet en vergelijkbaar zijn tussen alle omstandigheden die in hetzelfde experiment worden uitgevoerd.
Er zijn kritische stappen in de neurosfeer cultuur die aandacht nodig hebben. In de hersenen oogsten stap, volledige verwijdering van de hersenvliezen en een goede isolatie van de neurogene niches zijn essentieel om de zuiverheid en opbrengst van NSC’s te maximaliseren. Tijdens weefseldissociatie kan als gevolg van de proteolytische activiteit van trypsine overmatig gebruik van trypsine of langere incubatietijden leiden tot cellyse. Bovendien is de dag van de passage van cruciaal belang om een gezonde populatie van neurosferen te verkrijgen. Voorbijgaande neurosferen met een diameter hoger dan 200 μm heeft een grote invloed op de levensvatbaarheid, de proliferatie en de onderscheidende capaciteit van NSPc’s. Belangrijk is dat langere cycli van passages, meer dan 10 genetische instabiliteit kunnen verhogen6. Bovendien is coating met RESPECTIEVELIJK PDL en PLD/laminine voor SVZ- en DG-cellen essentieel om een goede celmigratie uit de neurosferen te garanderen zonder het differentiatieproces in gevaar te brengen. In termen van de immunocytochemie analyse, langere incubatietijden met PFA kan ingevaar brengen kleuring door het maskeren van de antigenen en het verhogen van de achtergrond.
De NSA is een krachtig instrument voor het verstrekken van een consistente en een onbeperkte bron van NSSP’s voor in vitro studies van neurale ontwikkeling en differentiatie, alsmede voor therapeutische doeleinden16,17. Deze test kan immers worden toegepast op genetische en gedragsmodellen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de proliferatie van DEPC en differentiatie18,19verder te begrijpen. Deze test is ook nuttig om verschillende geneesmiddelen en verbindingen te testen20,21,22 evenals om genetische manipulaties uit te voeren19,23 om NSC eigenschappen te moduleren. Naast immunocytochemie, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie en westerse vlek analyse kan worden uitgevoerd om toegang te krijgen tot RNA en eiwit expressie, terwijl elektrofysiologische studies en calcium beeldvorming kan worden gebruikt om de functie van de pasgeboren neuronen te evalueren21.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door IF/01227/2015 en UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) en R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) kregen een beurs van FCT. De auteurs willen de leden van de bioimaging faciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes bedanken voor microscopie assistentie.
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |