Synthese van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, hun vervoeging met de Siderophore Feroxamine en de evaluatie voor bacteriën detectie
Summary
Dit werk beschrijft protocollen voor de bereiding van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vermenging met deferoxamine met behulp van een succinyl moiety als linker. Een diepe structurele karakteriseringsbeschrijving en een vangstbacteriëntest met behulp van Y. enterocolitica voor alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat worden ook in detail beschreven.
Abstract
In het huidige werk, de synthese van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vervoeging met deferoxamine, een siderophore erkend door Yersinia enterocolitica, met behulp van een succinyl moiety als een linker worden beschreven.
Magnetische nanodeeltjes (MNP) van magnetiet (Fe3O4) werden bereid volgens de solvothermale methode en bekleed met SiO2 (MNP@SiO2) met behulp van het Stöber-proces gevolgd door functionalisatie met APTES (MNP@SiO2@NH2). Vervolgens werd feroxamine geconjugeerd met de MNP@SiO2@NH2 door carbodiimide koppeling om MNP@SiO2@NH2@Fa te geven. De morfologie en eigenschappen van de conjugaat en tussenproducten werden onderzocht door acht verschillende methoden, waaronder poeder X-Ray diffractie (XRD), Fourier transformeren infrarood spectroscopie (FT-IR), Raman spectroscopie, Röntgenfoto elektronenspectroscopie (XPS), transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en energiedispersieve X-Ray (EDX) mapping. Deze uitputtende karakterisering bevestigde de vorming van het conjugaat. Ten slotte, om de capaciteit en specificiteit van de nanodeeltjes te evalueren, werden ze getest in een vangst bacteriën test met behulp van Yersinia enterocolitica.
Introduction
De bacteriedetectiemethoden met behulp van MNP zijn gebaseerd op de moleculaire herkenning van antilichamen, aptamers, bioproteïne, koolhydraten die door de pathogenebacteriënaan MNP worden geconjugeerd. Rekening houdend met het feit dat siderophores worden herkend door specifieke receptoren op het buitenste membraan van bacteriën, kunnen ze ook gekoppeld zijn aan MNP om hun specificiteit te verhogen2. Siderophores zijn kleine organische moleculen die betrokken zijn bij de Fe3+ opname door bacteriën3,4. De voorbereiding van conjugaten tussen siderophores en MNP samen met hun evaluatie voor het vangen en isoleren van bacteriën is nog niet gemeld.
Een van de cruciale stappen in de synthese van conjugaten van magnetische nanodeeltjes met kleine moleculen is de selectie van het type binding of interactie tussen hen om ervoor te zorgen dat het kleine molecuul is bevestigd aan het oppervlak van de MNP. Om deze reden was de procedure voor de voorbereiding van de conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en feroxamine – de siderophore erkend door Yersinia enterocolitica– gericht op het genereren van een aanpasbaar oppervlak van de MNP om het covalent te koppelen aan de siderophore door carbodiimide chemie. Om een uniforme magnetiet nanodeeltjes (MNP) te krijgen en om de nucleatie- en groottecontrole te verbeteren, werd een solvolysereactie met benzylalcohol in een thermisch blok gedragen zonder te schudden5. Vervolgens werd een silica coating gegenereerd door Stöber methode om bescherming te verlenen en de stabiliteit van de nanodeeltjes suspensie in waterige media6te verbeteren. Rekening houdend met de structuur van de feroxamine is de introductie van aminegroepen noodzakelijk om geschikte nanodeeltjes (MNP@SiO2@NH2) te produceren die met de zijroprhore moeten worden geconjugeerd. Dit werd bereikt door condensatie van (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) met de alcoholgroepen die aanwezig zijn op het oppervlak van de silica gemodificeerde nanodeeltjes (MNP@SiO2) met behulp van een sol-gel methode7.
Tegelijkertijd werd het feroxamineijzer(III) complex bereid door de complexiteit van de commercieel verkrijgbare deferoxamine met ijzeracetylacetonaat in waterige oplossing. NN-succinylferoxamine, met succinylgroepen die als linkers zullen fungeren, werd verkregen door de reactie van feroxamine met barnische anhydride.
De conjugatie tussen MNP@SiO2@NH2 en N-succinylferoxamine om MNP@SiO2@NH@Fa te geven werd uitgevoerd door middel van carbodiimide chemie met behulp van als koppeling reagentia benzotriazole-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium hexafluorfosfaat (BOP) en 1-hydroxybenzotriazool (HOBt) in een zachte basismedia om de terminalzuurgroep in N-succinylferoxamine8te activeren. N
Zodra de parlementsleden werden gekarakteriseerd, evalueerden we de mogelijkheden van kale en gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes om wild type (WC-A) en een mutant van Y. enterocolitica zonder feroxaminereceptor FoxA (FoxA WC-A 12-8) vast te leggen. Gewone parlementsleden, gefunctionaliseerde parlementsleden en de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa mochten communiceren met elke Y. enterocolitica stam. De bacteriën-conjugaat aggregaten werden gescheiden van de bacteriën suspensie door de toepassing van een magnetisch veld. De gescheiden aggregaten werden twee maal gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw opgehangen in PBS om seriële verdunningen voor te bereiden en vervolgens werden ze verguld voor het tellen van kolonies. Dit protocol toont elke stap van de synthese van MNP@SiO2@NH@Fa, de structurele karakterisering van alle tussenproducten en de conjugaat, en een bacterievangsttest als een gemakkelijke manier om de specificiteit van het conjugaat ten opzichte van de tussenproducten te evalueren. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de synthese van een conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en de siderophore feroxamine door covalente binding. De synthese van magnetiet werd uitgevoerd met behulp van het protocol gerapporteerd door Pinna et al.5 gevolgd door silica coating om de magnetische kern van corrosie in waterige systemen te beschermen, om de aggregatie te minimaliseren en om een geschikt oppervlak voor functionalisatie6te bieden. Het silica coating proces werd aangepast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dankbaar Professor Klaus Hantke (Universiteit van Tübingen, Duitsland) voor het vriendelijk leveren van de Yersinia enterocolitica stammen die in dit werk worden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door subsidies AGL2015-63740-C2-1/2-R en RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) van het Staatsagentschap voor Onderzoek (AEI) van Spanje, medegefinancierd door het FEDER-programma van de Europese Unie. Werk aan de Universiteit van Santiago de Compostela en de Universiteit van A Coruña werd ook ondersteund door subsidies GRC2018/018, GRC2018/039 en ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategische groep) van Xunta de Galicia. Tot slot willen we Nuria Calvo bedanken voor haar geweldige samenwerking met de voice-off van dit videoprotocol.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
