Estabelecendo in Situ Circuito Fechado Perfusão de Órgãos Abdominais Inferiores e Membros Traseiros em Camundongos
Summary
Um protocolo é descrito para a perfusão in situ do corpo inferior do camundongo, incluindo a bexiga, a próstata, órgãos sexuais, osso, músculo e pele do pé.
Abstract
A ex-perfusão é uma importante ferramenta fisiológica para estudar a função de órgãos isolados (por exemplo, fígado, rins). Ao mesmo tempo, devido ao pequeno tamanho de órgãos de camundongos, a perfusão ex vivo de órgãos ósseos, bexiga, pele, próstata e reprodução é desafiadora ou inviável. Aqui, relatamos pela primeira vez um circuito de perfusão do corpo in situ em camundongos que inclui os tecidos acima, mas contorna os principais órgãos de liberação (rim, fígado e baço). O circuito é estabelecido por cannulação da aorta abdominal e veia cava inferior acima da artéria ilíaca e veia e cauterização dos vasos sanguíneos periféricos. A perfusão é realizada através de uma bomba peristáltica com fluxo perfusado mantido por até 2 h. A coloração in situ com lectina fluorescente e solução Hoechst confirmou que a microvasculatura foi perfundida com sucesso. Este modelo de camundongo pode ser uma ferramenta muito útil para estudar processos patológicos, bem como mecanismos de entrega de drogas, migração/metástase de células tumorais circulantes para/a partir do tumor, e interações do sistema imunológico com órgãos e tecidos perfumados.
Introduction
A perfusão isolada de órgãos foi originalmente desenvolvida para estudar a fisiologia de órgãos para transplante1,,2,,3, e possibilitou a compreensão das funções dos órgãos sem interferência de outros sistemas corporais. Por exemplo, a perfusão renal e cardíaca isolada foi imensamente útil na compreensão dos princípios básicos da hemodinâmica e dos efeitos dos agentes vasoativos, enquanto a perfusão hepática foi importante para a compreensão da função metabólica, incluindo o metabolismo medicamentoso no tecido saudável e doente4,,5,,6,7. Além disso, os estudos de perfusão foram fundamentais na compreensão da viabilidade e função dos órgãos destinados ao transplante. Na Pesquisa do Câncer, a perfusão de tumores isolados foi descrita por vários grupos usando camundongos, ratos e tecidos humanos recentemente ressecados8,,9. Em alguma perfusão tumoral isolada, o tumor foi implantado na almofada de gordura do ovário para forçar o crescimento do tumor que fornece vasos sanguíneos da artéria mesenteria10. O grupo Jain realizou estudos pioneiros utilizando perfusão isolada de adenocarcinomas de cólon para entender hemodinâmica tumoral e metástase8,,11,,12,13. Outras configurações inovadoras projetadas ex vivo incluem um dispositivo de perfusão à base de placas de 96 poços para cultivar as células primárias de mieloma múltiplo humano14 e uma câmara de fluxo modular para engenharia de arquitetura de medula óssea e pesquisa de funções15.
Além dos estudos de fisiologia e patologia, a perfusão de órgãos tem sido utilizada para estudar os princípios básicos do parto de medicamentos. Assim, um grupo descreveu a perfusão isolada de membros de ratos e estudou o acúmulo de lipossomos em sarcomas implantados16, enquanto outro grupo realizou perfusão renal humana dissecada para estudar o direcionamento endotelial de nanopartículas17. Ternullo et al. usaram um retalho de pele humana perfusado isolado como um modelo de penetração de drogas de pele quase in vivo18.
Apesar desses avanços na perfusão de grandes órgãos e tecidos, não houve relatos sobre modelos in situ perfusion em camundongos que: a) desobstruem órgãos de desobstrução, como fígado, baço e rins; b) incluir órgãos pélvicos, pele, músculo, órgãos reprodutivos (no masculino), bexiga, próstata e medula óssea. Devido ao pequeno tamanho desses órgãos e ao fornecimento de vasculatura, a canulação ex vivo e o estabelecimento de um circuito de perfusão não foram viáveis. O rato é o modelo animal mais importante em pesquisa sobre câncer e imunologia, e entrega de medicamentos. A capacidade de permear pequenos órgãos de camundongos permitiria que perguntas interessantes sobre o fornecimento de medicamentos a esses órgãos, inclusive para tumores implantados na pelve (bexiga, próstata, ovário, medula óssea), fossem respondidas, bem como estudos de fisiologia básica e imunologia de doenças desses órgãos. Para lidar com essa deficiência, desenvolvemos um circuito in situ de perfusão em camundongos que pode potencialmente evitar lesões teciduais e é muito mais adequado para pesquisa funcional do que perfusão de órgãos isolados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O circuito descrito pode ser usado para sondar várias questões de pesquisa, por exemplo, o papel de diferentes componentes séricos e barreiras teciduais no fornecimento de drogas, ou tráfico de células-tronco e imunes. Diferentes sistemas de entrega de medicamentos (por exemplo, lipossomos e nanopartículas) podem ser adicionados ao perfusato, a fim de entender o papel dos fatores fisiológicos e bioquímicos na entrega. A duração da perfusão pode variar, dependendo do tecido estudado, dos objetivos científicos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado pela concessão do NIH CA194058 ao DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 31771093), o Projeto de Colaboração Internacional da Província de Jilin (nº 201180414085GH), os Fundos Fundamentais de Pesquisa para as Universidades Centrais, o Programa de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia da JLU (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
