Etablere in situ lukket krets perfusjon av nedre abdominal organer og hind lemmer i mus

Summary

En protokoll er beskrevet for in situ perfusjon av musens underkropp, inkludert blæren, prostata, kjønnsorganer, bein, muskel og fothud.

Abstract

Ex vivo perfusjon er et viktig fysiologisk verktøy for å studere funksjonen av isolerte organer (f.eks lever, nyrer). Samtidig, på grunn av den lille størrelsen på museorganer, er ex vivo perfusjon av bein, blære, hud, prostata og reproduktive organer utfordrende eller ikke mulig. Her rapporterer vi for første gang en in situ underkroppsperfusjonskrets hos mus som inkluderer vevet ovenfor, men omgår de viktigste klaringsorganene (nyre, lever og milt). Kretsen er etablert ved kannulere abdominal aorta og dårligere vena cava over iliac arterie og vene og cauterizing perifere blodkar. Perfusjon utføres via en peristaltisk pumpe med perfusatstrøm opprettholdt i opptil 2 timer. In situ ging med fluorescerende lectin og Hoechst løsning bekreftet at mikrovaskulaturen ble vellykket perfundert. Denne musemodellen kan være et svært nyttig verktøy for å studere patologiske prosesser samt mekanismer for legemiddellevering, migrasjon / metastase av sirkulerende tumorceller inn i / fra svulsten, og interaksjoner av immunsystemet med perfused organer og vev.

Introduction

Isolert organperfusjon ble opprinnelig utviklet for å studere organfysiologi for^{transplantasjon 1,,2,,3}, og aktivert forståelse av organers funksjoner uten forstyrrelser fra andre kroppssystemer. For eksempel var isolert nyre- og hjerteperfusjon utrolig nyttig i å forstå grunnleggende prinsipper for hemodynamikk og effekter av vasoaktive midler, mens leverperfusjon var viktig for å forstå metabolsk funksjon, inkludert stoffskifte i sunt og sykt vev^4,5,6,7. I tillegg var perfusjonsstudier avgjørende for å forstå levedyktighet og funksjon av organer beregnet for transplantasjon. I Kreftforskningsforsker har isolert tumorperfusjon blitt beskrevet av flere grupper som bruker mus, rotte og nyoppdaget menneskelig vev^8,9. I noen isolert tumorperfusjon ble svulsten implantert i eggstokkfettputen for å tvinge veksten av svulst som leverer blodkar fra mesenterien¹⁰. Jain-gruppen utførte banebrytende studier ved hjelp av isolert perfusjon av kolonadenokarsinomer for å forstå tumorhemodynamikk og metastase^8,,11,,12,13. Andre innovative konstruerte ex vivo oppsett inkluderer en 96-brønn plate-basert perfusjon enhet for å kultur den primære menneskelige multippel myelomceller¹⁴ og en modulær flytkammer for engineering benmargsarkitektur og funksjon forskning¹⁵.

I tillegg til fysiologi- og patologistudier har organperfusjon blitt brukt til å studere de grunnleggende prinsippene for legemiddellevering. Dermed beskrev en gruppe isolert rottelemperfusjon og studerte akkumulering av liposomer i implanterte sarkomer¹⁶, mens en annen gruppe utførte dissekert human nyreperfusjon for å studere endotelmålretting av nanopartikler¹⁷. Ternullo et al. brukte en isolert perfused menneskelig hudklaff som en nær-in vivo hud narkotika penetrasjon modell¹⁸.

Til tross for disse fremskrittene i perfusjon av store organer og vev, har det ikke vært noen rapporter om in situ perfusjonsmodeller hos mus som: a) bypass clearance organer som lever, milt og nyrer; b) inkluderer bekkenorganer, hud, muskel, reproduktive organer (hos hann), blære, prostata og benmarg. På grunn av den lille størrelsen på disse organene og den forsynende vaskulaturen, har ex vivo cannulation og etablering av en perfusjonskrets ikke vært mulig. Musen er den viktigste dyremodellen innen kreft- og immunologiforskning, og legemiddellevering. Evnen til å perfuse små museorganer ville tillate interessante spørsmål om legemiddellevering til disse organene, inkludert til svulster implantert i bekkenet (blære, prostata, eggstokk, benmarg), som skal besvares, samt studier av grunnleggende fysiologi og immunologi av sykdommer i disse organene. For å løse denne mangelen utviklet vi en in situ perfusjonskrets hos mus som potensielt kan unngå vevsskade og er mye bedre egnet for funksjonell forskning enn isolert organperfusjon.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av University of Colorado’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Forvarm perfusjonssystemet Forbered perfusjonssystemet før operasjonen ved å starte et 37 °C sirkulerende vannbad for alle vannjakkede komponenter (perfusatreservoar, fuktig kammer og lokk) som vist i en tilpasset konfigurasjon i figur 1A. Pass på at slangen er ren og skift om nødvendig ut. For å begrense perfusat…

Representative Results

Vi satte opp et lukket kretsperfusjonssystem gjennom kanyling av abdominal aorta og den dårligere vena cava av 8-10 uker gamle mus samtidig som volumet av perfusjonsbuffer mindre enn 10 ml. Figur 3A viser konfukale bilder etter perfusing vev med Ringers løsning som inneholder Hoechst 33342 og DyLight 649-lectin. Muskel, benmarg, testis, blære, prostata og fothud viser effektiv kjernefysisk og vaskulær farging. Figur 3B viser hematoxylin-eosin farging av orga…

Discussion

Den beskrevne kretsen kan brukes til å undersøke ulike forskningsspørsmål, for eksempel rollen til ulike serumkomponenter og vevsbarrierer i legemiddellevering, eller immun- og stamcellehandel. Ulike legemiddelleveringssystemer (f.eks. liposomer og nanopartikler) kan legges til perfusatet for å forstå rollen som fysiologiske og biokjemiske faktorer i levering. Varigheten av perfusjon kan variere, avhengig av vevet som er studert, vitenskapelige mål og sammensetningen av perfusat. Vi presenterer her resultatene av …

Materials

Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023