Ett protokoll beskrivs för in situ perfusion av musens underkropp, inklusive urinblåsan, prostatan, könsorgan, ben, muskler och fot hud.
Ex vivo perfusion är ett viktigt fysiologiskt verktyg för att studera funktionen hos isolerade organ (t.ex. lever, njurar). Samtidigt, på grund av den lilla storleken på musorgan, ex vivo perfusion av ben, urinblåsa, hud, prostata, och reproduktiva organ är utmanande eller inte genomförbart. Här rapporterar vi för första gången en in situ underkroppperfusion krets hos möss som innehåller ovanstående vävnader, men kringgår de viktigaste clearance organ (njure, lever och mjälte). Kretsen är etablerad genom kanylerande buken stora kroppspulsådern och sämre vena cava ovanför höftartären och ven och cauterizing perifera blodkärl. Perfusion utförs via en peristaltisk pump med perfusat flöde bibehålls i upp till 2 h. In situ färgning med fluorescerande lektin och Hoechst lösning bekräftade att microvasculature var framgångsrikt perfused. Denna mus modell kan vara ett mycket användbart verktyg för att studera patologiska processer samt mekanismer för läkemedelstillförsel, migration / metastasering av cirkulerande tumörceller till/ från tumör, och interaktioner av immunsystemet med perfunderade organ och vävnader.
Isolerade organ perfusion utvecklades ursprungligen för att studera organfysiologi för transplantation1,2,3,och möjliggjorde förståelse av funktioner i organ utan störningar från andra kroppssystem. Till exempel, isolerade njure och hjärta perfusion var oerhört användbart för att förstå grundläggande principer för hemodynamik och effekter av vasoaktiva medel, medan leverperfusion var viktigt att förstå den metaboliska funktionen, inklusive läkemedelsmetabolism i friska och sjuka vävnad4,5,6,7. Dessutom var perfusionsstudier avgörande för att förstå livskraft och funktion hos organ avsedda för transplantation. I Cancer Researchearch, isolerade tumör perfusion har beskrivits av flera grupper med hjälp av mus, råtta, och nyligen resected mänskliga vävnader8,9. I vissa isolerade tumör perfusion, tumören implanterades i äggstocken fett pad att tvinga tillväxten av tumör levererar blodkärl från mesenteri artär10. Jain gruppen utfört banbrytande studier med isolerad perfusion av kolon adenokarcinom att förstå tumör hemodynamik och metastasering8,11,12,13. Andra innovativa konstruerade ex vivo-inställningar inkluderar en 96-väl plåtbaserad perfusionsenhet för att odla de primära mänskliga multipelt myelomcellerna14 och en modulär flödeskammare för ingenjörskonsterad benmärgsarkitektur och funktionsforskning15.
Förutom fysiologi och patologi studier, organ perfusion har använts för att studera de grundläggande principerna för läkemedelstillförsel. Således beskrev en grupp isolerade råtta lem perfusion och studerade ansamling av liposomer i implanterade sarkom16, medan en annan grupp utförs dissekeras mänskliga njurperfusion att studera endotel inriktning av nanopartiklar17. Ternullo et al. använde en isolerad perfunderad mänsklig hudflik som en nära-till-in vivo hud drog penetration modell18.
Trots dessa framsteg i perfusion av stora organ och vävnader, det har inte förekommit några rapporter om in situ perfusion modeller hos möss som: a) kringgå clearance organ såsom lever, mjälte och njurar; b) inkluderar bäckenorgan, hud, muskler, reproduktionsorgan (hos män), urinblåsa, prostata och benmärg. På grund av dessa organs ringa storlek och den tillförsel vasculature, ex vivo cannulation och etablering av en perfusion krets har inte varit möjligt. Musen är den viktigaste djurmodellen inom cancer- och immunologiforskning och läkemedelsleverans. Förmågan att granska små musorgan skulle tillåta intressanta frågor om läkemedelsleverans till dessa organ, inklusive till tumörer implanteras i bäckenet (urinblåsan, prostata, äggstock, benmärg), som skall besvaras, samt studier av grundläggande fysiologi och immunologi av sjukdomar i dessa organ. För att åtgärda denna brist utvecklade vi en in situ perfusion krets hos möss som potentiellt kan undvika vävnadsskada och är mycket bättre lämpad för funktionell forskning än isolerade organ perfusion.
Den beskrivna kretsen kan användas för att undersöka olika forskningsfrågor, till exempel rollen av olika serumkomponenter och vävnadsbarriärer vid läkemedelsleverans, eller immun- och stamcellshandel. Olika drug delivery-system (t.ex. liposomer och nanopartiklar) kan läggas till perfusatet för att förstå de fysiologiska och biokemiska faktorernas roll vid leverans. Varaktigheten av perfusion kan variera, beroende på vävnaden studerade, vetenskapliga mål, och sammansättningen av perfusate. Vi presenterar h…
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes av NIH-bidraget CA194058 till DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (anslag nr 31771093), projektet för internationellt samarbete av Jilin-provinsen (no.201180414085GH), grundforskningsfonderna för de centrala universiteten, programmet för JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Equipment | |||
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
Materials | |||
19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Reagents | |||
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |