Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite

Qiongxia Lyu; Huifei  Sophia Zheng; Karly Laprocina; Chen-Che Jeff Huang

doi:10.3791/60868

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Articolo metodologico

Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite

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DOI:

10.3791/60868

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21 febbraio 2020

Qiongxia Lyu¹^,² , Huifei Sophia Zheng² , Karly Laprocina² , Chen-Che Jeff Huang²

¹College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, ²Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In questo articolo

Sommario

Sono stati stabiliti diversi metodi per l'immunostaining multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. Qui, descriviamo l'uso di anticorpi mediati a microonde e di fluoroforo-tiramide per bloccare la reattività incrociata dell'anticorpo durante l'immunostaining multiplex su sezioni adrenali del topo con paraffina fissata in formalina.

Abstract

L'immunostazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per mostrare il modello di espressione cellulare di una data proteina. L'immunostaining multiplex consente l'etichettatura utilizzando più anticorpi primari. Per ridurre al minimo la reattività incrociata degli anticorpi, l'immunostaining multiplex che utilizza la colorazione indiretta richiede anticorpi primari senza etichetta provenienti da diverse specie ospiti. Tuttavia, la combinazione appropriata di diversi anticorpi di specie non è sempre disponibile. Qui, descriviamo un metodo di utilizzo di anticorpi primari non etichettati provenienti dalla stessa specie ospite (ad esempio, in questo caso entrambi gli anticorpi provengono dal coniglio) per l'immunofluorescenza multiplex sulle sezioni surrenali con paraffina fissata a formalina (FFPE). Questo metodo utilizza la stessa procedura e reagenti utilizzati nella fase di recupero dell'antigene per rimuovere l'attività del complesso anticorpale primario precedentemente macchiato. I vetrini sono stati macchiati con il primo anticorpo primario utilizzando un protocollo di immunostaining generale seguito da un passo di legame con un anticorpo secondario biotinylato. Poi, un metodo di sviluppo del segnale avidina-biotina-perossidasi è stato utilizzato con fluoroforo-tiramide come substrato. L'immunoattività del primo complesso di anticorpi primari è stata ridotta attraverso l'immersione in una soluzione di citrato di sodio bollente a microonde per 8 min. La deposizione insolubile fluoroforo-tiramide è rimasta sul campione, il che ha permesso di colorare la diapositiva con altri anticorpi primari. Anche se questo metodo elimina la maggior parte dei segnali falsi positivi, alcuni sfondi da anticorpo reattività incrociata può rimanere. Se i campioni sono arricchiti con biotina endogena, un anticorpo secondario coniugato perossidia può essere utilizzato per sostituire l'anticorpo secondario biotinylato per evitare il falso positivo dalla biotina endogena recuperata.

Introduzione

Nell'immunostaining multiplex, la colorazione diretta che utilizza anticorpi primari coniugati può fornire risultati informativi. Senza l'uso di anticorpi secondari, il metodo di colorazione diretta ha un basso rischio di falsi segnali di co-localizzazione da reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, i reporter coniugati (fluoroforo, enzimi) o biotina sull'anticorpo primario ne limitano l'uso futuro. In alternativa, l'immunostaining indiretto di solito fornisce segnali più forti utilizzando un anticorpo primario non coniugato con un anticorpo secondario etichettato. Idealmente, gli anticorpi primari non coniugati utilizzati nell'immunostaining multiplex dovrebb....