細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ
Summary
オソノ付着アッセイは、ワクチン開発における抗体のオプソニック機能を評価するオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。
Abstract
オソノ付着アッセイは、細菌病原体のプロの食細胞への付着を列挙する機能的アッセイです。アギャンスは食細胞性および殺死に必要であるため、アッセイはオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。オソノ付着アッセイの利点は、不活性化病原体と哺乳類細胞株を使用するオプションであり、複数の実験で標準化が可能です。アッセイにおける不活性化病原体の使用はまた、バイオセーフティレベル3感染因子および他の有害な病原体との作業を容易にする。我々の研究では、オソノ付着アッセイは、抗体の機能的能力を評価するために使用され、炭疽菌カプセルベースのワクチンで免疫された動物のセラから、固定 バチルスアントラシス の固定されたアテンスをマウスマクロファージ細胞株RAW 264.7に付着誘導する。マクロファージに付着したバチルの画像を捕捉するために、自動蛍光顕微鏡を用いた。接着性の増加は、血清中の抗カプセル抗体の存在と相関していた。高い血清抗カプセル抗体濃度を示した非ヒト霊長類は炭疽菌の挑戦から保護された。従量的に、オソノ付着アッセイは、セラにおける抗原特異的抗体の生物学的機能を解明し、ワクチン候補および他の治療薬の有効性を評価し、免疫の可能な相関として役立つものとして使用することができる。
Introduction
認識、付着、内在化、および病原体の分解は、貪食症1に不可欠であり、1883年2、3年にイヤ・メチニコフによって最初に説明された宿主の自然免疫応答における顕著な経路である。食細胞性白血球は、免疫系の他の細胞と同様に、標的の選択において非常に差別的である。それらは、パターン認識受容体(PRR)4,5のレパートリーによって病原体関連分子パターンを介して「感染性非自己」と「非感染自己」を区別することができる。病原体の宿主認識は、補体および抗体6などの宿主オプソニンの結合と共に起こり得る。このプロセスは、オプソナイゼーションと呼ばれ、これらの分子で病原体をコーティングし、食作用細胞6上のオプソニック受容体(例えば、補体およびFc受容体)への結合時の内在化を増強する。病原体が食細胞に付着するためには、複数の受容体と同結合リガンドの集合的結合が必要である。そうして初めて、ホストセル内のシグナル伝達カスケードを付着して、内部化を開始することができます。
病原体のクリアランスと感染予防における貪食の重要性のために、細胞外病原体は生存を延長するためにこのプロセスを破壊する多くの方法を開発してきました。重要な1つの戦略は、その電荷によって抗貪食性であるアニオン性高分子(例えば、多糖またはポリアミノ酸)カプセルの製造であり、免疫原性が低く、そしてPR6,7から細菌エンベロープ上の分子を遮蔽する。クリプトコッカス・ネオフォルマンや肺炎球菌などの病原体は、糖類ポリマーで構成されるカプセルを有するのに対し、ブドウ球菌は表皮基内および一部のバチルス種がポリɣグルタミン酸(PGGA)7,8を産生する。しかし、他の病原体は、非感染性の自己に似たカプセルを生成します。例えば、B.セレウスの連鎖球菌性菌株および病原性株は、抗貪食性であるだけでなく、免疫系9,10によって異物として認識されないヒアルロン酸カプセルを有する。
カプセルをキャリアタンパク質に結合すると、それらを貧しいT依存性抗原から高い免疫原性T依存性抗原に変換し、高血清抗カプセル抗体力剤11,12を誘導することができる。この戦略は、S. 肺炎,血友病インフルエンザ ,および Neisseria 髄膜炎菌に対するライセンスワクチンに採用されています。抗カプセル抗体のオプソニック作用は、一般的にオソノ貪食性殺死アッセイ(OPKA)13、14、15、16によって評価されている。これらのアッセイは、機能性抗体が貪食を引き起こし、14を殺すことができるかどうかをテストする。しかし、B.アントラシス17を含む、第1層生物学的選択剤や毒素(BSAT)などの感染病原体とのOPKAの使用は危険であり、セキュリティリスクを伴う。これらのアッセイは、選択剤の広範な取り扱いを必要とする。選択剤の取り扱いは、制限されたバイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所でのみ行うことができます。これらの分野での作業は、従わなければならない多数の安全およびセキュリティ上の予防措置のために長引く操作手順を要求する。BSL-3の実験室はまた顕微鏡およびサイトメーターのようなOPKAの仕事のために使用される専門の装置と一般に装備されていない。そこで、不活化菌18,19の使用に基づく代替アッセイを開発した。我々はこれを、内部化とアッセイ出力としての殺害に依存しないオプソノ付着アッセイ(OAA)と呼ぶ。代わりに、オプゾン化不活化病原体の付着は、貪食の指標として使用される。OAAは、付着が先験的に起こり、内在化および細胞内殺滅と密接に絡み合っているので、OAAは適切な代替物である。バイオセーフティの観点から、OAAは、感染性薬剤の最小の取り扱いを必要とし、OPKAよりも実験的に短い期間であり、そして不活性化病原体のストックが産生および移送された後にBSL-2研究所で行うことができるので好ましい。
カプセルコンジュゲートでワクチン接種した非ヒト霊長類(NHP)の血清に見られる抗カプセル抗体のオプソニック機能を調べるOAAの利用を実証する[すなわち、B.アントラシスからナイセリア髄膜炎の外膜タンパク質複合体(OMPC)に結合したB.アントラシスからのPGGA]20。血清オプゾン化バチル酸は、付着マウスマクロファージ細胞株、RAW 264.7でインキュベートした。固定後、細胞単層及び接着性バチルを蛍光顕微鏡で画像化した。細菌の付着は、バチル菌を対照血清20と比較してカプセルコンジュゲートでワクチン接種したNHPから血清でインキュベートした場合に増加した。付着は炭疽菌チャレンジ20,21の生存と相関した。従って、OAAの使用は抗カプセル抗体の機能を特徴づけ、ワクチン候補の試験を大いに促進した。
Protocol
Representative Results
Discussion
カプセル系ワクチンは、多数の細菌病原体に対して有効性が示されており、多くはヒト25、26、27での使用に対してライセンスされている。これらのワクチンは、カプセルを標的とする抗体を生成することによって働き、これらの研究の多くはOPKAを用いて、抗体13、14、16、28、29のオソノ貪食機能を示す。<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.チュア、D.シャボット、A.フリードランダーは、原稿に記載されている手順を設計しました。J.チュアとT.プトモン・テイラーが実験を行った。D. Chabot はデータ分析を実行しました。J.チュアは原稿を書いた。
著者らは、優れた技術支援のためにカイル・J・フィットに感謝します。
この作業は、国防脅威削減庁の助成金CBMによって支援されました。VAXBT.03.10.RD.015、プラン番号921175。
意見、解釈、結論、勧告は著者のものであり、必ずしもアメリカ陸軍によって承認されるとは限りません。本書の内容は、必ずしも国防総省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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