Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة
Summary
إن فحص أوبوسونو- الالتزام هو طريقة بديلة لتشقيم القتل الفاتجية من مكتب العمليات لتقييم الوظائف opsonic للأجسام المضادة في تطوير اللقاحات.
Abstract
مقايسة opsono الالتزام هو اختبار وظيفية أن يعدد تعلق مسببات الأمراض البكتيرية إلى البلعات المهنية. لأن الالتزام هو شرط لالبالمعموم والقتل، والمقايسة هو طريقة بديلة لopsono-الفاتغة القتل المقايسة. ميزة من اختبار opsono الالتزام هو خيار استخدام مسببات الأمراض المعطلة وخطوط الخلايا الثديية ، والذي يسمح بتوحيد عبر تجارب متعددة. كما أن استخدام مسببات الأمراض المعطلة في الفحص يسهل العمل مع عوامل عدوى من المستوى 3 في مجال السلامة البيولوجية وغيرها من مسببات الأمراض الخبيثة. في عملنا، تم استخدام اختبار الالتزام opsono لتقييم القدرة الوظيفية للأجسام المضادة، من سيرا من الحيوانات المحصنة مع لقاح كبسولة الجمرة الخبيثة، للحث على الالتزام بالجمرة الخبيثة عصيات ثابتة لخط خلية الضامة الماوس، RAW 264.7. تم استخدام المجهر الفلورسي الآلي لالتقاط صور للعصيات التمسك الضامة. وارتبطت زيادة الالتزام بوجود أجسام مضادة للكبسولات في المصل. وكانت الرئيسيات غير البشرية التي أظهرت تركيزات عالية من الأجسام المضادة للكبسولات في المصل محمية من تحدي الجمرة الخبيثة. وهكذا، يمكن استخدام اختبار الالتزام opsono لتوضيح الوظائف البيولوجية للأجسام المضادة المستضدية المحددة في سيرا، لتقييم فعالية المرشحين لقاح والعلاجات الأخرى، وتكون بمثابة ارتباط ممكن من المناعة.
Introduction
الاعتراف، والالتزام، واستيعاب، وتدهور الممرض هي جزء لا يتجزأ من البلعموم1، وهو مسار بارز في الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة وصفها أولا Ilya Metchnikoff في 18832،3. الكريات البيض البلعوية، وكذلك خلايا أخرى في الجهاز المناعي، هي تمييزية للغاية في اختيارها من الأهداف؛ فهي قادرة على التمييز بين “المعدية غير الذاتي” و “غير المعدية الذاتي” من خلال أنماط مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية من قبل ذخيرة من مستقبلات التعرف على نمط (PRRs)4،5. قد يحدث أيضا اعتراف المضيف من مسببات الأمراض مع ربط أوبسونين المضيف، مثل الأجسام المكملة والأضداد6. هذه العملية، ودعا opsonization، المعاطف الممرض مع هذه الجزيئات، وتعزيز استيعاب عند ملزمة لمستقبلات opsonic (على سبيل المثال، مكملة ومستقبلات Fc) على الخلايا البلعومية6. بالنسبة لمسببات الأمراض للتمسك بالبلع، فإن الربط الجماعي لمستقبلات متعددة مع أربطةها المشتركة ضروري. وعندئذ فقط يمكن أن يؤدي الالتزام وإبقاء الشلالات إشارة داخل الخلية المضيفة لبدء استيعاب6.
نظرًا لأهمية البلعوم في إزالة مسببات الأمراض والوقاية من العدوى ، فقد طورت مسببات الأمراض خارج الخلية العديد من الطرق لتخريب هذه العملية لإطالة بقائها. استراتيجية واحدة من أهمية هو إنتاج البوليمرية anionic (على سبيل المثال، السكريات أو حمض البوليمينو) كبسولة التي هي المضادة للبولي فيغوسيتيك بحكم شحنتها، هو ضعف المناعة، والدروع جزيئات على المغلف البكتيري من PRRs6،7. مسببات الأمراض مثل Cryptococcusformans neoformans وStreptoptococcus pneumoniae كبسولات تتكون من البوليمرات saccharide ، في حين أن البشرة المكورات العنقودية وبعض أنواع Bacillus تنتج حمض poly-ɣ-glutamic (PGGA)7،8. ومع ذلك مسببات الأمراض الأخرى تنتج كبسولات تشبه النفس غير المعدية. على سبيل المثال، Pyogenes العقديات وسلالة مسببة للأمراض من B. cereus لديها كبسولة حمض الهيالوروني ليس فقط المضادة للبالثومية ولكن التي قد لا يتم الاعتراف بها أيضا الأجنبية من قبل الجهاز المناعي9،10.
الاقتران من كبسولة إلى البروتينات الناقل يحولهم من الفقراء, T-مستقلة المستضدات إلى مستضدات تعتمد على درجة عالية من المناعة T-تعتمد على أن يمكن أن تحفز عالية مصل المضادة للكبسولاتاتراتالأجسام المضادة 11,12. يتم استخدام هذه الاستراتيجية للقاحات مرخصة ضد S. الالتهاب الرئوي, الهيموفلوس الأنفلونزا, ونيسيريا التهاب السحايا11. وقد تم تقييم الأنشطة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة عادة من قبل opsono-الفاتغة القتل المقايسات (OPKA)13,14,15,16. هذه الاختبارات اختبار ما إذا كانت الأجسام المضادة الوظيفية يمكن أن تؤدي إلى البلعوم وقتل14. ومع ذلك، فإن استخدام مادة OPKA مع مسببات الأمراض المعدية، مثل عوامل الاختيار البيولوجية من المستوى 1 والتكسينات (BSAT)، بما في ذلك B. ANTHRACIs17، هو استخدام خطير ويعرض مخاطر أمنية؛ هذه المقايسات تتطلب معالجة واسعة النطاق من وكيل مختارة. لا يمكن أن يتم التعامل مع عوامل مختارة إلا في مختبرات المستوى المقيد للسلامة الأحيائية 3 (BSL-3)؛ يتطلب العمل في هذه المجالات إجراءات تشغيل مطولة بسبب العديد من احتياطات السلامة والأمن التي يجب اتباعها. كما أن مختبرات BSL-3 غير مجهزة عادة بالمعدات المتخصصة المستخدمة في أعمال OPKA، مثل المجاهر وأجهزة قياس السيت. وهكذا، قمنا بتطوير فحص بديل على أساس استخدام البكتيريا المعطلة18،19. ونشير إلى ذلك على أنه مقايسة للانضمام إلى مكتب العمليات لا تعتمد على النواتج المُستوعبة والقتل كمعان؛ بدلا من ذلك، يتم استخدام الالتزام مسببات الأمراض opsonized المعطلة كفهرس للبطلات. ميكانيكيا، OAA هو بديل مناسب لأن الالتزام يحدث مسبقا وتتشابك بشكل وثيق مع الداخل والقتل داخل الخلايا. ومن منظور السلامة الأحيائية، يفضل اغورا لأنه يتطلب الحد الأدنى من معالجة العامل المعدي، وهو تجريبي أقصر مدة من OPKA، ويمكن إجراؤه في مختبرات BSL-2 بعد أن يتم إنتاج ونقل مخزون من مسببات الأمراض المعطلة.
نحن نبرهن على استخدام OAA لفحص وظيفة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة وجدت في سيرا من الرئيسيات غير البشرية (NHPs) تطعيمها مع مركب كبسولة [أي PGGA من B. الجمرة الخبيثة مترافق إلى مجمع البروتين الغشاء الخارجي (OMPC) من التهاب السحايا Neisseria]20. تم احتضان عصيات المصل opsonized مع خط خلية الضامة الماوس الملتزم، RAW 264.7. بعد التثبيت ، تم تصوير الخلية أحادية الطبقات وعصيات المتمسك بها عن طريق المجهر المفلور. ازدادت نسبة الإلتزام البكتيري عندما تم احتضان العصيات بالمصل من NHPs التي تم تطعيمها بـ كبسولات مترافقة مقارنة بالمصل20. الالتزام يرتبط مع البقاء على قيد الحياة من التحدي الجمرة الخبيثة20,21. وهكذا، فإن استخدام اأو يتميز وظيفة الأجسام المضادة للكبسولات و سهل إلى حد كبير اختبار مرشح اللقاح لدينا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت أن اللقاحات القائمة على كبسولة تكون فعالة ضد العديد من مسببات الأمراض البكتيرية، والعديد منها مرخص للاستخدام في البشر25،26،27. تعمل هذه اللقاحات عن طريق توليد الأجسام المضادة التي تستهدف الكبسولة والعديد من هذه الدراسات تستخدم OPKA ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد صمم ج. تشوا و د. شابوت وأ. فريدلاندر الإجراءات الموصوفة في المخطوطة. وقد أجرى ج. تشوا وت. بوتمون – تايلور التجارب. دال- أجرى شابوت تحليل البيانات. ج. تشوا كتب المخطوطة.
يشكر المؤلفون كايل ج. فيت على المساعدة التقنية الممتازة.
وقد دعم هذا العمل منحة وكالة الحد من التهديدات الدفاعية. VAXBT.03.10.RD.015، رقم الخطة 921175.
الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلفين ولا يؤيدها بالضرورة الجيش الأمريكي. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الدفاع، كما لا يعني ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
