Method Article

빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

DOI:

10.3791/60886

⸱

April 23rd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, Elizabethtown College, 2Department of Psychiatry, Yale University, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.

Abstract

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판면 도파민 (DA) 복부 테지멘트 영역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens 보상 처리 및 강화 학습에 중추적 인 역할을한다. VTA 제어 면질 DA 방출에 다양한 뉴런 입력이 보상 처리 및 보강 학습을 제어하는 회로의 더 나은 그림을 제공 할 수있는 방법을 이해. 여기서는 생체내 고속 스캔 순환 볼탐법(FSCV)에서 측정한 약리학 작용제 및 길항제의 인트라-VTA 캐뉼라 주입을 자극-황량한 Phasic DA 방출(결합된 주입 및 자극 또는 CIS)과 결합하는 방법을 설명합니다. 마취된 쥐에서 CIS-FSCV를 사용하여, 핵 accumbens 코어에서 기록하는 동안 캐뉼라가 장착된 양극성 전극으로 VTA를 전기적으로 자극함으로써 면학적 DA 반응을 불러질 수 있다. 약리학 작용제 또는 길항제는 특정 VTA 수용체의 역할을 조사하기 위해 자극 부위에 직접 주입될 수 있다. CIS-FSCV의 주요 장점은 VTA 수용체 기능이 생체 내에서 연구될 수 있다는 것입니다.

Introduction

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Phasic 도파민 (DA) 복부 tegmental 지역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens에 (NAc) 보상 관련 행동에 중요 한 역할을 한다. VTA DA 뉴런은 토닉형 발사(3-8Hz)에서 폭발형 발사(>14Hz)1로전환하여 NAc에서 면세 DA 방출을 생성합니다. VTA는 토닉에서 버스트 발사2,3,4,5로의전환을 조절할 수 있는 다양한 소마토덴드리틱수용체를 표현한다. 이러한 수용체중 어느 수용체와 그들의 각각의 입력을 식별, 제어 Phasic DA 릴리스보상 관련 회로가 조직되는 방법에 대한 우리의 이해를 심화합니다. 여기에 설명된 방법론의 목적은, 빠른 스캔 순환 볼탐법(CIS-FSCV)과 결합된 주입 및 자극을 결합하여, Phasic DA 방출을 구동하는 VTA 수용체의 기능을 빠르고 강력하게 평가하는 것이다.

결합된 주입 및 자극(CIS)이라는 용어는 뉴런(여기 VTA) 그룹에 약리적으로 수용체를 조작하고 수용체의 기능을 연구하기 위해 그 뉴런을 자극하는....

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Protocol

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모든 실험은 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 엘리자베스 타운 대학과 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 CIS-FSCV를 활용하는 마취 된 쥐 준비에 특정합니다.

1. 외과 전 준비

  1. 전극 용액 준비
    1. 전극 백필 용액을 만들기 위해 염화 16140mM 칼륨으로 아세테이트 4M의 용액을 준비한다.
  2. 전극 준비
    1. 진공 흡입을 사용하여 T-650 탄소 섬유 (직경 7 μm)를 borosilicate 유리 모세관 (길이 = 100mm, 직경 = 1.0mm, 내부 직경 = 0.5 mm)에 삽입하십시오.
    2. 탄소 섬유가 유리 모세관 내부에 놓이면 유리 모세관을 수직 전극 풀러에 넣고 열 원소는 모세관 한가운데에 대략 배치합니다. 자석을 끄고 히터를 55로 설정합니다.
    3. 모세관을 당긴 후, 전극의 끝이 가열 요소에 의해 포위되지 않도록 조심스럽게 상부 모세관 홀더를 올립니다.
    4. 날카로운 가위를 사용하여 여전히 모세관의 두 조각을 연결하는 탄소 섬유를 잘라냅니다. 이로 인해 ....

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Results

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CIS-FSCV는 NAc 코어에서 phasic DA 방출을 구동하는 VTA N-메틸-D-아스파르타테 수용체(NMDAR), 니코티닉 아세틸콜린 수용체(nAChRs), 무스카리닉 아세틸콜린 수용체(mAChRs)의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 도 2는 음의 제어, 0.9% 식염수의 주입, 이전(기준선) 및 9분 후유혈(식염수)에 대한 대표적인 데이터를 나타낸다. 도 2는 y축, x축의 시간, z축의 시간 및 전류(거짓 색으로 표현됨)를 나타내는 색상 플롯을 나타내며, 현재 대 시간 추적(IvT)에, 그리고 피크에서 촬영한 순환 형 voltammogram은 DA에 해당한다는 것을 입증한다. 예상대로, 식염수 주입자극된 Phasic DA 방출을 변경하지 않았다.

.......

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Discussion

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CIS-FSCV는 Phasic DA 방출의 기본 VTA 수용체 메커니즘을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 적절한 레코딩을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 호출된 DA 신호에서 약간의 드리프트와 함께 안정적인 기준선 레코딩을 달성해야 합니다. 안정적인 레코딩을 구축할 가능성을 높이는 중요한 방법은 전극이 60Hz와 10Hz 모두에서 사이클링할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하는 것입니다(일반적으로 60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분). 탄소 섬유가 순환됨에 따라 탄소 섬유 자체가 산화되어 에칭되어 표면적을 감소시켰지만 도파민흡착(23)에대한 새로운 표면을 생성한다. 이로 인해 DA에 대한 민감도가 증가할 수 있습니다. 따라서, 하나는 이 증가 에칭으로 인해 실험에 시간이 지남에 자극 도파민 릴리스에 약간의 증가를 볼 수 있습니다. 또한 초기 마취의 90~120분 이내에 녹음을 시작하면 장시간 안정적인 레코딩이 발생할 가능성이 높아집니다. 이와 같이,.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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작업은 엘리자베스 타운 대학 (R.J.W, M.L., 그리고 L.M.), NSF 대학원 펠로우십 (R.J.W.) 및 예일 의과 대학 (N.A.)에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
전극 충전 솔루션/용품
MicropipetteWorld Precision InstrumentsMF286-5 (28 게이지)
Potassium AcetateSigma236497-100G
Potassium ChlorideSigmaP3911-25G
전극 공급
탄소 섬유ThornelT650
전극 풀러Narishige InternationalPE-22참고: 수평 풀러도 사용할 수 있습니다
유리 모세관A-M 시스템626000
전극용 절연 전선Weico Wire and Cable IncorporatedUL 1423길이; 10 cm; 지름, 0.4mm; 맞춤 제작해야 합니다; 절연 재료는 덮어야 합니다. 와이어
광 현미경 5cm(전극 보기 및 절단용)Fischer ScientificM3700
PinPhoenix EnterprisesHWS1646절연 전극 와이어 및 기준 전극에 납땜; 헤드스테이지
PuttyAlcolin23922-1003탄소 섬유를 절단하는 동안 전극을 배치하는 데 사용됩니다
Scalpal BladeWorld Precision Instruments500239탄소 섬유를 적절한 길이로 절단하기 위해
Silver WireSigma327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday CageU-LineH-3618 (36" x 24" x 42")
PotentiostatUniv. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrodePlasticsOneMS303/2-A/SPC주문 시 받침대 아래 22mm 절단 TarHeel
HDCV SoftwareUniversity of North Carolina-Chapel Hill- 주문 정보 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI 브레이크아웃 박스Univ. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ 주문 정보
UEI 전원 공급 장치Univ. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ 주문 정보
Stimulator Hardware
Neurolog 자극 아이솔레이터Digitimer Ltd.DS4Neurolog 800A
주입/자극 용품
주입 펌프New Era 주사기 펌프NE-300
내부 캐뉼러플라스틱OneC315I/SPC INTERNAL 33GA
마이크로리터 주사기Hamilton80308
튜빙플라스틱OneC313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Canulla HolderKopf Instruments1776 P-1
코튼 팁 애플리케이터Vitality Medical806
전극 홀더Kopf Instruments1770
가열 패드Kent ScientificRT-0501
포비돈 요오드Vitality Medical29906-004
나사StoeltingBone Anchor Screws/Pkg.of 1001.59 mm O.D., 3.2 mm 길이
Silver Wire Reference with AgClInVivo MetricE255A
Square GauzeVitality Medical441408
StereotaxKopf InstrumentsModel 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
FormulinSigma1004960700
전원 공급 장치BK Precision9110
SucroseSigma80497
텅스텐 미세 전극MicroProbesWE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-아미노-5-포스포노발레르산시그마 알드리치A5282
N-메틸-D-아스파르테이시그마 알드리치M3262
메카밀아민 염산염(M9020-5mg)시그마 알드리치M9020
스코폴라민 하이드로 브로마이드(S0929-1G)시그마 알드리치S0929
. . 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  2. Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamin....

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Ventral Tegmental AreaPhasic Dopamine ReleaseFast Scan Cyclic VoltammetryCombined Infusion StimulationNucleus Accumbens CoreCarbon Fiber MicroelectrodeBipolar Stimulating ElectrodePharmacological Agonists AntagonistsIn Vivo RecordingReceptor Regulation

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